不同彈性模量靜電紡絲聚氨酯纖維支架對兔纖維環(huán)干細(xì)胞分化的調(diào)控研究.pdf

1、本文從以下及部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 兔纖維環(huán)徑向分區(qū)差異性的鑒定
　　目的:探討兔纖維環(huán)沿徑向不同區(qū)域的細(xì)胞形態(tài)、生化組成、基因表達(dá)及生物力學(xué)等方面的差異性。
　　方法:獲取6月齡新西蘭白兔的椎間盤纖維環(huán)組織,將其沿徑向分為內(nèi)、中、外三個區(qū),經(jīng)膠原酶消化分離出各區(qū)纖維環(huán)原代細(xì)胞,比較各區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異,檢測各區(qū)細(xì)胞的增殖情況,定量分析各區(qū)細(xì)胞I型膠原(Collagen-I)、II型膠原(Collagen-II)

2、和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的基因表達(dá),通過H&E、番紅O-固綠染色、及Collagen-I和Collagen-II免疫組化染色考察各區(qū)組織中膠原和蛋白聚糖(PG)的分布,定量檢測各區(qū)組織中DNA、糖胺聚糖(GAG)、羥脯氨酸(HYP)、Collagen-I和Collagen-II的含量,利用細(xì)胞牽引力顯微術(shù)(Cell traction force microscope,CTFM)測定各區(qū)細(xì)胞的牽引力,通過納米壓痕和拉伸測試分別從

3、微觀和宏觀方面測定各區(qū)組織的壓應(yīng)力和拉應(yīng)力。
　　結(jié)果:分離并培養(yǎng)得到纖維環(huán)內(nèi)、中、外三區(qū)細(xì)胞,其中內(nèi)區(qū)細(xì)胞主要呈圓形或類軟骨細(xì)胞形態(tài),外區(qū)細(xì)胞主要呈梭形或類成纖維細(xì)胞形態(tài),中區(qū)細(xì)胞則具有內(nèi)外區(qū)的混合細(xì)胞形態(tài);三個區(qū)的細(xì)胞均具有很好的增殖能力;RT-qPCR檢測結(jié)果顯示內(nèi)區(qū)Collagen-II和Aggrecan表達(dá)量最高,外區(qū)Collagen-I的表達(dá)量最高,而中區(qū)的這些基因表達(dá)則介于內(nèi)外區(qū)之間;H&E染色發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)組織內(nèi)大部分

4、分布的是膠原,番紅O-固綠染色則顯示內(nèi)區(qū)被染成橘紅色,表明PG的含量高,而外區(qū)被染成藍(lán)綠色,表明主要為膠原纖維;免疫組化染色發(fā)現(xiàn)由內(nèi)、中到外區(qū)Collagen-I表達(dá)量逐漸增高,而Collagen-II表達(dá)量則逐漸減少,這也與酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)的結(jié)果相一致;另外,組織學(xué)定量檢測發(fā)現(xiàn)從內(nèi)、中到外區(qū)DNA和HYP的含量逐漸增高,而GAG的含量逐漸遞減;CTFM檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)區(qū)細(xì)胞牽引力最大,而外區(qū)細(xì)胞牽引力最小,中區(qū)細(xì)胞牽引力介于

5、內(nèi)外區(qū)之間;微觀納米壓痕和宏觀拉伸測試結(jié)果均顯示由內(nèi)、中到外區(qū)纖維環(huán)組織彈性模量呈遞增趨勢。
　　結(jié)論:椎間盤纖維環(huán)在徑向內(nèi)、中、外區(qū)域其細(xì)胞類型、基質(zhì)生化組成、基因表達(dá)和生物力學(xué)特性方面都存在明顯的差異。
　　第二部分 兔纖維環(huán)干細(xì)胞的分離和鑒定
　　目的:從兔纖維環(huán)中分離和鑒定纖維環(huán)組織特異性干細(xì)胞。
　　方法:獲取6周齡新西蘭白兔的纖維環(huán)組織,經(jīng)膠原酶消化后得到纖維環(huán)源細(xì)胞,培養(yǎng)至細(xì)胞集落相互接觸后進(jìn)行傳代

6、;測定細(xì)胞克隆集落形成率及最佳初始接種密度,并觀察結(jié)晶紫染色的細(xì)胞集落和細(xì)胞形態(tài),接著使用最佳初始接種密度完成后續(xù)干細(xì)胞鑒定實驗。首先檢測纖維環(huán)源集落形成細(xì)胞(Annulus fibrosus derived colony forming cells,AFDCFCs)的自我更新及增殖能力,RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光檢測典型間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá),并進(jìn)一步鑒定AFDCFCs成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)分化潛能,最后檢測AFDCFCs在不同

7、彈性模量聚丙烯酰胺凝膠(PAG)上培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)、增殖情況、生化組成、基因表達(dá)和細(xì)胞力學(xué)測試。
　　結(jié)果:兔纖維環(huán)源細(xì)胞在培養(yǎng)3-4天后形成細(xì)胞克隆集落,當(dāng)初始接種密度為200 cells/cm2時達(dá)到最佳的細(xì)胞集落形成率,約3.4％。MTT檢測顯示AFDCFCs具有強(qiáng)大的自我更新和增殖能力?；驒z測發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44和CD166為陽性表達(dá),而CD4,CD8 CD14為陰性表達(dá),進(jìn)一步細(xì)胞免疫熒光顯示Oct-

8、4,Nucelostemin(NS)和SSEA-4的干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)為陽性。AFDCFCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后能向成骨、成軟骨和成脂方向分化,分別經(jīng)Alizarin Red S、Safranin O和Oil Red O染色后呈陽性,而各自相對應(yīng)的基因表達(dá),如成骨細(xì)胞的Runx-2和Collagen-I基因、軟骨細(xì)胞的Sox-9和Collagen-II基因、脂肪細(xì)胞的PPAR-γ和LPL基因,均呈陽性表達(dá)。AFDCFCs在不同彈性模量PAG上培養(yǎng)

9、后,細(xì)胞形態(tài)觀察顯示第1、4、7和14天在最軟的凝膠基材上細(xì)胞較小多呈圓形,而在最硬的凝膠基材上細(xì)胞較大呈多邊形或長梭形,中等硬度凝膠基材上生長的細(xì)胞多呈橢圓形或短梭形;CCK-8檢測顯示在各組凝膠上培養(yǎng)的細(xì)胞均能增殖;RT-qPCR定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Collagen-I表達(dá)量隨著凝膠的彈性模量增大而逐漸增高,然而,Collagen-II和Aggrecan的表達(dá)量則逐漸減少;ELISA定量檢測結(jié)果均發(fā)現(xiàn)Collagen-I含量隨著凝膠的彈

10、性模量增大而逐漸增高,然而,Collagen-II和GAG含量則逐漸減少;CTFM檢測發(fā)現(xiàn)在越硬的凝膠上細(xì)胞牽引力越小,相反,培養(yǎng)在越軟的凝膠上牽引力越大。
　　結(jié)論:成功分離和鑒定了兔AFDCFCs,這些細(xì)胞表現(xiàn)出具有集落形成能力、可自我更新、表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物、具有多向分化潛能等特性,與間充質(zhì)干細(xì)胞的典型特征一致,另外,其分化具有基材彈性模量依賴性,據(jù)此將這類細(xì)胞定義為纖維環(huán)干細(xì)胞(Annulus fibrosus ste

11、m cells,AFSCs)。
　　第三部分 不同彈性模量聚氨酯靜電紡絲支架的制備
　　目的:制備具有不同彈性模量聚氨酯靜電紡絲纖維支架。
　　方法:首先選擇四組化學(xué)成分相似而彈性模量不同的聚氨酯材料,通過拉伸測試和納米壓痕測試來明確四組聚氨酯材料的彈性模量;然后將聚氨酯溶于六氟異丙醇中,配置成一定濃度的溶液,抽取2ml的聚氨酯溶液置于微量注射泵上,接通高壓直流電源,在15KV的高壓電場中以0.8ml/h的速度噴射出纖

12、維紡絲;使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察靜電紡絲纖維支架的微觀結(jié)構(gòu),并將需要做細(xì)胞培養(yǎng)的靜電紡絲纖維支架放入24孔板中,滅菌,分別用DMEM-LG培養(yǎng)液和含10％FBS的DMEM-LG培養(yǎng)液浸泡,待用。
　　結(jié)果:通過拉伸測試和納米壓痕測試得到四組聚氨酯材料的彈性模量值,其中拉伸測試所獲得的彈性模量分別為:2.5±0.4,5.1±0.4,6.8±0.5,13.4±0.7MPa;獲得四組聚氨酯靜電紡絲纖維支架;SEM觀察發(fā)現(xiàn)四組彈性

13、模量的聚氨酯靜電紡絲纖維粗細(xì)及孔隙均勻一致,單根纖維直徑約1-2μm。
　　結(jié)論:成功制備出四組具有不同彈性模量聚氨酯靜電紡絲纖維支架。
　　第四部分 兔纖維環(huán)干細(xì)胞在不同彈性模量聚氨酯支架上分化
　　目的:考察兔纖維環(huán)干細(xì)胞在不同彈性模量聚氨酯靜電紡絲纖維支架上分化后的細(xì)胞形態(tài)、生化組成、基因表達(dá)和細(xì)胞力學(xué)狀況,并與實際纖維環(huán)徑向各區(qū)域?qū)?yīng)的趨勢比較。
　　方法:將兔纖維環(huán)干細(xì)胞培養(yǎng)于四組不同彈性模量的聚氨酯靜

14、電紡絲纖維支架上,分別在第1、4、7、14天行免疫熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài),檢測各組細(xì)胞的增殖情況,RT-qPCR定量分析各組細(xì)胞的I型膠原(Collagen-I)、II型膠原(Collagen-II)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的基因表達(dá),定量檢測各組細(xì)胞的DNA、糖胺聚糖(GAG)、Collagen-I、Collagen-II的含量,利用細(xì)胞牽引力顯微術(shù)(CTFM)測定各組細(xì)胞牽引力(CTF)的大小。
　　結(jié)果:兔纖維環(huán)干細(xì)

15、胞在不同彈性模量的聚氨酯靜電紡絲纖維支架上培養(yǎng)后,FITC-Phalloidin和DAPI染色顯示第1、4、7和14天各組細(xì)胞形態(tài)不受到基材的彈性模量影響,呈多邊形或不規(guī)則形;CCK-8檢測顯示在各組支架上培養(yǎng)的纖維環(huán)干細(xì)胞均能增殖;RT-qPCR定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Collagen-I表達(dá)量隨著纖維支架的彈性模量增大而逐漸增高,然而,Collagen-II和Aggrecan的表達(dá)量則逐漸減少;ELISA定量檢測結(jié)果均發(fā)現(xiàn)Collagen-