重癥肌無力幼鼠經(jīng)鼻粘膜耐受的免疫學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)動(dòng)物模型的建立。 目的：利用乙酰膽堿受體(AChR)單克隆抗體mAb35，采用預(yù)實(shí)驗(yàn)成功建立MG動(dòng)物模型的最佳劑量(1.0mg/Kg)，腹腔注射(ip)給C57BL6(B6)幼年小鼠，建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)動(dòng)物模型，并鑒定模型建立是否成功。為進(jìn)一步研究MG的發(fā)病機(jī)理及其相應(yīng)的免疫治療方法提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 方法：將實(shí)驗(yàn)組分為2組(模型組M和正常對(duì)照組C)，

2、模型組(M)C57BL/6幼年小鼠經(jīng)腹腔注射含mAb35 1.0mg/kg的Ringer's液0.2ml，對(duì)照組(C)小鼠經(jīng)腹腔注射不含mAb35的Ringer's液0.2ml。對(duì)小鼠進(jìn)行臨床表現(xiàn)的觀察，低頻重復(fù)電刺激檢查(RNS)，EIJSA法檢測(cè)血清中的AChR-Ab水平，以判斷模型建立是否成功。 結(jié)果：經(jīng)腹腔注射含mAb35的Ringer’s液12～24h后，大部分模型組小鼠出現(xiàn)體重減輕、活動(dòng)減少、肌力降低等MG臨床癥狀，

3、而正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)、攝食如常，無1例出現(xiàn)臨床癥狀。模型組小鼠表現(xiàn)肌無力和易疲勞的臨床表現(xiàn)，同時(shí)伴有肌電圖衰減、新斯的明試驗(yàn)陽性、血清學(xué)中AChR-Ab升高的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，所有這些均與MG患者的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果相似，也符合MG的病理生理特點(diǎn)。結(jié)論：C57BL/6小鼠為建立EAMG動(dòng)物模型的敏感品系。利用AChR單克隆抗體mAb35可在幼年C57BL/6小鼠成功建立EAMG模型，其有效劑量為1.0mg/kg，該方法簡(jiǎn)便、可靠，為

4、研究?jī)和疢G提供了一種很好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 第二部分重癥肌無力幼鼠經(jīng)鼻粘膜耐受的免疫學(xué)機(jī)制研究。 目的：采用特異性耐受原一雙類似物(Lys262-Ala207)，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)幼鼠進(jìn)行鼻粘膜給藥，觀察臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)指標(biāo)的改變情況，評(píng)價(jià)其臨床療效、探討鼻粘膜耐受對(duì)EAMG的預(yù)防效果及作用機(jī)制，以期為兒童MG的治療提供一種理論依據(jù)，為臨床探索MG的防治方法開辟一條新的途徑。 方

5、法：應(yīng)用單克隆抗體mAb35腹腔注射致敏C57BL/6(B6)幼年小鼠建立EAMG模型，選取雙類似物L(fēng)ys262-Ala207作為耐受原在致敏前10d(預(yù)防耐受組A)及致敏當(dāng)日(預(yù)防耐受組B)給予含有25μg耐受肽的PBS 50μL鼻腔給藥，每個(gè)鼻孔25μL，連續(xù)10d。而相應(yīng)對(duì)照組CA、CB按照相同時(shí)間程序，鼻飼含有等量不含耐受肽的PBS50μL，每個(gè)鼻孔25μL。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組小鼠體重、觀察臨床評(píng)分、低頻重復(fù)電刺激檢查(RNS)，檢測(cè)

6、血清抗AChR-Ab水平以及IL-lO、IL-4和IFN-γ分泌細(xì)胞含量變化和小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞(MNC)中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化情況。 結(jié)果： (1)A、B兩組小鼠未出現(xiàn)體重下降而臨床癥狀明顯輕于相應(yīng)對(duì)照組，且A組臨床癥狀輕于B組。 (2)神經(jīng)電生理檢查：A、B兩組低頻重復(fù)電刺激(RNS)出現(xiàn)衰減反應(yīng)D5陽性率低于各自對(duì)照組。 (3)A、B兩組小鼠血清中乙酰膽堿受體抗體AChR-Ab的水平

7、明顯低于各自對(duì)照組，且A組輕于B組。 (4)A、B組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中IL-4、IFN-γ、IL-10分泌細(xì)胞含量均低于各自對(duì)照組，且A組低于B組。 (5)實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟MNC中調(diào)節(jié)性CD4+CD25+Tr細(xì)胞含量A組明顯高于B組，且A、B組明顯高于各自對(duì)照組。 結(jié)論： 1.雙類似物(Lys262-Ala207)經(jīng)鼻粘膜耐受對(duì)預(yù)防實(shí)驗(yàn)幼鼠發(fā)生EAMG具有較好的效果，除臨床癥狀較輕外，且伴有特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞免

8、疫功能的抑制，即：血清AChR-Ab含量明顯減少，外周血中IL-4、IFN-γ、IL-10分泌降低，CD4+CD25+Tr細(xì)胞含量明顯增加。 2.雙類似物(Lys262-Ala207)經(jīng)鼻粘膜耐受可下調(diào)針對(duì)AChR自身免疫反應(yīng)的作用，不同的時(shí)間點(diǎn)預(yù)防耐受效果不同，致敏前優(yōu)于致敏時(shí)耐受，提示自身免疫反應(yīng)一旦啟動(dòng)再給予耐受的療效要遜于自身免疫反應(yīng)啟動(dòng)前耐受治療。 3.本研究證實(shí)雙類似物經(jīng)鼻粘膜耐受治療EAMG有效、給藥途徑方