神經(jīng)甾體對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及相關(guān)作用機(jī)制初探.pdf

1、目的：認(rèn)知功能障礙性疾病特別是阿爾茨海默氏病、血管性癡呆等，是發(fā)生于老年前期和老年期十分常見(jiàn)的神經(jīng)精神性疾病。其較為突出的臨床特點(diǎn)為進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶功能減退、行為障礙、情緒異常等。神經(jīng)甾體參與焦慮、抑郁等應(yīng)激情緒反應(yīng)的調(diào)控，以及驚厥、睡眠、神經(jīng)再生和生物晝夜節(jié)律等的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)淄體對(duì)學(xué)習(xí)記憶具有調(diào)控作用。孕烯醇酮硫酸酯(pregnenolone sulfate，PREGS)和脫氫表雄酮硫酸酯(dehydroepiandrostero

2、ne sulfate，DHEAS)等神經(jīng)甾體可協(xié)同促進(jìn)γ-氨基丁酸受體GABAA的功能、抑制谷氨酸離子型受體NMDA的功能，進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性和突觸可塑性，促進(jìn)動(dòng)物覺(jué)醒、記憶獲取及鞏固。而側(cè)腦室給予別孕烯醇酮(allopregnanolone，AP)可損傷動(dòng)物的空間認(rèn)知能力。腦內(nèi)膽堿系統(tǒng)參與學(xué)習(xí)、記憶、驚厥和注意力等許多活動(dòng)。腦內(nèi)乙酰膽堿(Acetycholine，Ach)水平的平衡對(duì)維持腦的高級(jí)功能的正常運(yùn)作至關(guān)重要。不同腦區(qū)膽堿

3、功能損傷、膽堿系統(tǒng)代謝酶水平改變以及膽堿能受體數(shù)目減少均與許多認(rèn)知障礙性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Morris水迷宮進(jìn)行的相關(guān)行為學(xué)評(píng)價(jià)可以用于疾病相關(guān)模型的判斷。M受體東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶損傷的大鼠模型被廣泛應(yīng)用，用以理解發(fā)生在老齡的記憶損害和特定的病理狀態(tài)以及篩選具有促進(jìn)認(rèn)知功能的有效藥物。本研究通過(guò)制備東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶損傷的大鼠模型，測(cè)定模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力以及神經(jīng)甾體水平的變化，并進(jìn)一步測(cè)定給予神經(jīng)甾體干預(yù)后動(dòng)物行為學(xué)及相關(guān)酶學(xué)

4、指標(biāo)，以探討神經(jīng)甾體對(duì)東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶損傷模型大鼠的影響及其可能的機(jī)制，為學(xué)習(xí)記憶障礙性疾病機(jī)制的闡明和神經(jīng)甾體的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1分組和藥物處理方案
　　 1.1東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶損傷的大鼠模型的制備
　　 體重200～220g雄性Sprague Dawley(SD)大鼠16只，隨機(jī)分為模型組和生理鹽水對(duì)照組，每組8只。在水迷宮實(shí)驗(yàn)前30min模型組每只大鼠按2.0

5、mg·kg-1腹腔注射東莨菪堿，對(duì)照組注射相應(yīng)體積生理鹽水。應(yīng)用Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測(cè)試，與生理鹽水對(duì)照組相比，行為學(xué)成績(jī)顯著降低表示模型制備成功。
　　 1.2孕酮對(duì)學(xué)習(xí)記憶損傷大鼠的影響及相關(guān)機(jī)制
　　 40只體重200～220g雄性SD大鼠，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、模型組、孕酮低劑量組（4mg·kg-1）、孕酮中劑量組（8mg·kg-1）、孕酮高劑量組(16mg·kg-1)，每組8只

6、。水迷宮實(shí)驗(yàn)前60min，孕酮各劑量組每只大鼠背部皮下注射相應(yīng)劑量孕酮，對(duì)照組和模型組大鼠背部皮下注射相應(yīng)劑量的空白藥用注射用油。實(shí)驗(yàn)前30min，模型組和孕酮各劑量組每只大鼠按2.0mg·kg-1劑量腹腔注射東莨菪堿，對(duì)照組大鼠腹腔注射相應(yīng)體積生理鹽水。
　　 2.指標(biāo)的檢測(cè)
　　 2.1 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試
　　 第1～5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)。每天在固定時(shí)間開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將大鼠從固定入水點(diǎn)面向池壁放入水中

7、，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期，若大鼠在180s內(nèi)未尋找到平臺(tái)則記錄逃避潛伏期為180s，并引導(dǎo)其尋找到平臺(tái)。每只大鼠訓(xùn)練完畢后無(wú)論是否尋找到平臺(tái)，均將其放至平臺(tái)上停留10s。第7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后間隔1天撤去平臺(tái)，將大鼠從固定入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄大鼠第一次到達(dá)原平臺(tái)所在位置的時(shí)間以及其在180s內(nèi)跨越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。
　　 2.2樣品中神經(jīng)甾體的提取和測(cè)定
　　 空間探索實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)束后將大鼠斷頭處死，取軀干血于肝素管中，并離心取上層血漿備神經(jīng)甾體檢測(cè)使用。迅速剝開(kāi)顱骨，參考大鼠腦立體定位圖譜，在冰冷的生理鹽水中分離出皮質(zhì)和海馬，稱(chēng)重后置于-70℃下保存?zhèn)渖窠?jīng)甾體檢測(cè)使用。參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法稍加改進(jìn)，使用乙酸乙酯/正己烷(9/1，v/v)液液萃取和固相小柱兩步法提取神經(jīng)甾體，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定血漿和腦組織樣品中的神經(jīng)甾體的含量。
　　 2.3樣品中乙酰膽堿酯酶的測(cè)定
　　

9、空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠斷頭處死，迅速剝開(kāi)顱骨，參考大鼠腦立體定位圖譜，在冰冷的生理鹽水中分離出皮質(zhì)和海馬，稱(chēng)重后用生理鹽水制成10％(m/V)組織勻漿，4℃下3500r·min-1離心10min，取上清液參照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作進(jìn)行反應(yīng)測(cè)定。同時(shí)用紫外吸收法測(cè)定每個(gè)樣本中蛋白含量以進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)。
　　 結(jié)果：
　　 1神經(jīng)甾體測(cè)定方法學(xué)確證
　　 本實(shí)驗(yàn)所用神經(jīng)甾體測(cè)定方法中DHEA、PREG、AP、PROG和

10、內(nèi)標(biāo)MT與腦組織及血漿成分分離效果良好，無(wú)干擾。腦組織樣品和血漿樣品中DHEA、PREG、AP和PROG在0.015～4.5ng·ml-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。腦組織中DHEA、PREG、AP、PROG日內(nèi)和日間變異系數(shù)分別小于7.6％和7.2％、7.7％和7.9％、8.0％和5.7％、7.9％和4.5％(n=5)；血漿中DHEA、PREG、AP、PROG的日內(nèi)和日間變異系數(shù)分別小于8.1％和7.0％、6.7％和12.3％、8.0％

11、和6.4％、8.1％和6.6％(n=5)。
　　 2 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果
　　 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組和生理鹽水對(duì)照組兩組大鼠尋找到隱匿平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期均隨學(xué)習(xí)天數(shù)的增加而呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期在第3天開(kāi)始顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。空間探索實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照組相比，模型組大鼠第1次到達(dá)原平臺(tái)位置時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），跨越原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。說(shuō)

12、明東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶損傷的大鼠模型制備成功。
　　 給予孕酮預(yù)處理后，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在5天的訓(xùn)練過(guò)程當(dāng)中隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠的逃避潛伏期均呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)。與模型組相比，第3天開(kāi)始，孕酮低、中劑量組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），從第2天開(kāi)始，孕酮高劑量組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）。空間探索實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，孕酮三個(gè)劑量組大鼠第1次到達(dá)原平臺(tái)位置時(shí)間均顯著縮短（P＜0.05）。與模型組相比

13、，孕酮低、中劑量組大鼠跨越原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)與模型組有增加趨勢(shì)，但差異沒(méi)有顯著性（P＞0.05），孕酮高劑量組大鼠跨越原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)顯著增加（P＜0.05）。
　　 3樣品中神經(jīng)甾體水平的改變
　　 與生理鹽水對(duì)照組相比，東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶損傷形成時(shí)，模型組大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)PREG水平顯著下降（P＜0.05），DHEA、AP和PROG水平無(wú)顯著性改變；模型組大鼠海馬內(nèi)DHEA、PREG、AP和PROG水平無(wú)顯著改變；模

14、型組大鼠血漿中PROG水平顯著升高(P＜0.05)，DHEA、PREG和AP水平無(wú)顯著性改變。
　　 4樣品中乙酰膽堿酯酶水平的改變
　　 與生理鹽水對(duì)照組相比，東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶損傷形成時(shí)，模型組大鼠額葉皮質(zhì)和海馬中AchE活性顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，孕酮各劑量組大鼠額葉皮質(zhì)和海馬中AchE活性均降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1 M受體拮抗劑東莨菪堿致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷時(shí)，腦

15、內(nèi)神經(jīng)甾體合成代謝發(fā)生了明顯改變，大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)PREG含量顯著降低。提示神經(jīng)甾體合成代謝可能參與了M受體系統(tǒng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　 2東莨菪堿致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷時(shí)，外周神經(jīng)甾體合成代謝也發(fā)生了明顯改變，血漿中PROG水平顯著升高。推測(cè)東莨菪堿可能通過(guò)拮抗M受體影響內(nèi)分泌系統(tǒng)，尤其是與甾體激素合成密切相關(guān)的HPA軸的活性，參與大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的調(diào)節(jié)。
　　 3外源性PROG干預(yù)能通過(guò)抑制腦內(nèi)皮質(zhì)和海馬組織中Ac