FOXO1在霍奇金淋巴瘤中是一種抑癌基因.pdf

1、cHL淋巴瘤是一種特殊的腫瘤，其惡性腫瘤細(xì)胞--霍奇金鏡像細(xì)胞（HRS細(xì)胞）僅占腫瘤團(tuán)塊的大約1％，腫瘤組織中細(xì)胞成分中絕大多數(shù)為間質(zhì)細(xì)胞和浸潤(rùn)細(xì)胞。cHL 淋巴瘤屬于生發(fā)中心或者后生發(fā)中心B細(xì)胞來(lái)源的B細(xì)胞淋巴瘤，具有克隆性免疫球蛋白基因重組。與其他大多數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤不同的是，HRS細(xì)胞的免疫表型不同于任何造血細(xì)胞，幾乎不表達(dá)B細(xì)胞標(biāo)志。其可能的機(jī)制有多種，例如B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的缺乏、轉(zhuǎn)錄抑制因子的過(guò)表達(dá)，及表觀遺傳學(xué)機(jī)制，都被認(rèn)

2、為對(duì)B細(xì)胞特異性基因在HRS細(xì)胞中的表達(dá)有抑制作用。HRS細(xì)胞的另一個(gè)突出特點(diǎn)是，多種信號(hào)通路包括核因子κB（NF-κB）、Jak-Stat、PI3K-AKT/PKB、ERK、AP1和receptor tyrosine kinases (RTK)通路，以及EB 病毒相關(guān)蛋白等的異常活化維持了HRS細(xì)胞的存活和增值。而AKT/PKB 通路和ERK 通路的一個(gè)重要下游靶因子是FOXO 轉(zhuǎn)錄因子家族。Forkhead 蛋白以擁有高保守DNA結(jié)

3、合區(qū)域the forkhead box 為特征。FOXO是forkhead 轉(zhuǎn)錄因子家族中被研究得最多的亞族之一。FOXO 家族由四位成員組成，分別是FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6。翻譯后共價(jià)修飾機(jī)制在FOXO 活性的調(diào)控中起到主要的作用。蛋白激酶包括AKT/PKB、IkB kinase（IKK）、SGK以及ERK，可磷酸化FOXO 蛋白，引起FOXO的核外轉(zhuǎn)移和降解，從而抑制其活性。通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因，F(xiàn)OXO 發(fā)揮抑

4、制生長(zhǎng)，誘導(dǎo)分化或者凋亡及對(duì)抗過(guò)氧化損傷等作用。已知的FOXO 靶基因包括細(xì)胞周期調(diào)控基因CCND2、CDKN1A和CDKN1B，前凋亡基因BIM，NOXA和FASL。成熟B細(xì)胞的存活依賴正常的BCR 信號(hào)通路，后者激活NF-κB，PI3KAKT/PKB等通路，促進(jìn)B細(xì)胞存活、增殖。缺乏正常BCR的B細(xì)胞不可避免的發(fā)生凋亡。近期研究表明，激活PI3K 通路或敲除FOXO1 可挽救缺失BCR 信號(hào)的B細(xì)胞的凋亡。
　　 目的：FO

5、XO 家族在多種類型腫瘤中發(fā)揮著重要的抑癌作用。研究表明FOXO1表達(dá)的下調(diào)與B細(xì)胞發(fā)育和存活有關(guān)，敲除FOXO1 可使缺失BCR 信號(hào)的B細(xì)胞免于凋亡并持續(xù)增殖。cHL的HRS細(xì)胞沒(méi)有正常的BCR 信號(hào)，卻能免于凋亡、并持續(xù)增殖。因此，我們假設(shè)：在成熟B細(xì)胞向cHL 惡性轉(zhuǎn)化中，F(xiàn)OXO1是否也扮演著抑癌基因的角色？
　　 方法：首先用Genesifter 軟件分析了網(wǎng)絡(luò)已發(fā)表的基因芯片數(shù)據(jù)，并以實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR），W

6、estern immunoblot和免疫組化的方式驗(yàn)證，以期闡明FOXO1在正常B細(xì)胞及淋巴瘤中的表達(dá)水平。在低表達(dá)FOXO1的cHL細(xì)胞株中，穩(wěn)定導(dǎo)入可誘導(dǎo)表達(dá)的FOXO1基因；Western immunoblot 驗(yàn)證導(dǎo)入基因的表達(dá)；利用FACS等方法檢測(cè)FOXO1表達(dá)對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株增殖、存活的影響；并進(jìn)一步通過(guò)qPCR驗(yàn)證了FOXO1 靶基因?qū)OXO1基因功能的貢獻(xiàn)。最后，我們用熒光原位雜交（FISH）和比較基因組雜交分析（ar

7、ray-CGH）檢測(cè)FOXO1基因組位點(diǎn)在cHL中是否有拷貝數(shù)缺失等突變。
　　 結(jié)果：利用Genesifter 軟件，我們比較了數(shù)據(jù)庫(kù)中FOXO1、FOXO3和FOXO4在HRS細(xì)胞及正常B 淋巴細(xì)胞亞群中的表達(dá)水平。在大多數(shù)B細(xì)胞亞型中，F(xiàn)OXO1的表達(dá)水平高于FOXO3和FOXO4，在生發(fā)中心B細(xì)胞—中心母細(xì)胞和中心細(xì)胞（CB+CC）中尤為顯著。cHL 淋巴瘤樣本中，F(xiàn)OXO1的表達(dá)水平顯著低于正常B細(xì)胞亞群，而FOXO3

8、和FOXO4的表達(dá)水平在正常B細(xì)胞與HRS細(xì)胞中并沒(méi)有顯著的差異。為了驗(yàn)證基因芯片分析所得的結(jié)果，我們用定量PCR的方法檢測(cè)了FOXO1和FOXO3在CD19+B細(xì)胞，cHL細(xì)胞株和Burkitt′s 淋巴瘤（BL）細(xì)胞株及其他B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中的表達(dá)。其結(jié)果與基因芯片分析結(jié)果相一致。FOXO1在CD19+B細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FOXO3。FOXO1在正常B細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于其在cHL細(xì)胞株中的表達(dá)水平。FOXO1的mR

9、NA 水平在cHL細(xì)胞株中最低，在BL細(xì)胞株中也降低，但比cHL細(xì)胞株表達(dá)水平高。Westernimmunoblot 結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1的蛋白表達(dá)水平在正常CD19+B細(xì)胞遠(yuǎn)高于cHL細(xì)胞株。為了排除FOXO1在cHL細(xì)胞株中的低表達(dá)水平是由于細(xì)胞株體外培養(yǎng)而造成的偏差，我們用FOXO1 抗體染色增生的扁桃體標(biāo)本和cHL 標(biāo)本。在扁桃體含有高密度中心母細(xì)胞的生發(fā)中心暗區(qū)(DZ)表現(xiàn)出強(qiáng)染色，同樣，幼稚B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞所在的濾泡套區(qū)f

10、ollicular mantle zone (MZ)也呈現(xiàn)出強(qiáng)染色。稍弱的染色在以中心細(xì)胞為主的生發(fā)中心亮區(qū)可見(jiàn)。在T細(xì)胞區(qū)可見(jiàn)少許FOXO1 陽(yáng)性細(xì)胞。在32例cHL 淋巴瘤樣本中，31例的霍奇金鏡像細(xì)胞的FOXO1表達(dá)為陰性，只有1例的霍奇金鏡像細(xì)胞FOXO1 呈現(xiàn)微弱的表達(dá)。相比之下，在HRS細(xì)胞周圍的反應(yīng)性細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1 呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。在20例臨床結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤（NLPHL）腫瘤標(biāo)本中，14例腫瘤細(xì)胞L&H

11、細(xì)胞FOXO1 染色呈陰性。為探討FOXO1的下調(diào)在cHL 腫瘤發(fā)生中的潛在作用，我們使用了一個(gè)可誘導(dǎo)的FOXO1(A3)ER 體系，A3 代表FOXO1基因的絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)分別被三個(gè)丙胺酸取代，導(dǎo)致FOXO1 蛋白不會(huì)被AKT/PKB和SGK 磷酸化，保證了FOXO1 蛋白的活性。而且，F(xiàn)OXO1 編碼區(qū)與突變的雌激素受體（ER）相融合，形成特殊的他莫昔芬可激活體系。經(jīng)Western immunoblot 驗(yàn)證，穩(wěn)定感染所得的L4

12、28、KMH2、L1236、UHO1和SUP-HD1 都成功表達(dá)FOXO1(A3)ER。然后，我們研究了FOXO1 激活后對(duì)cHL細(xì)胞株L428、KMH2、L1236、UHO1和SUP-HD1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1 激活后導(dǎo)致所有cHL細(xì)胞株活細(xì)胞數(shù)量顯著減少。FOXO 轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)激活或者抑制靶基因的表達(dá)而抑制生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡。因此，我們驗(yàn)證了靶基因?qū)OXO1基因功能的貢獻(xiàn)。CCND2 (cyclin D2)是細(xì)胞周

13、期G1/S 轉(zhuǎn)變所需的基因，在cHL中通常呈現(xiàn)高表達(dá)。FOXO1的激活顯著抑制了CCND2在cHL細(xì)胞株的表達(dá)。另外，細(xì)胞周期抑制基因CDKN1B (p27，Kip1)則在FOXO1 激活后被上調(diào)。FOXO1基因位于13q14。在探討FOXO1表達(dá)下調(diào)機(jī)制過(guò)程中，我們?cè)?3例臨床cHL 標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)6例有13q14 染色體缺失(11.3％)，在5種cHL細(xì)胞株中，有4種細(xì)胞株有不同程度的13q 染色體缺失。此外，我們發(fā)現(xiàn)針對(duì)AKT/PKB

14、或者M(jìn)EK1/2的抑制劑可部分恢復(fù)FOXO1在cHL細(xì)胞系的表達(dá)，而且這些抑制劑對(duì)FOXO1表達(dá)的促進(jìn)作用與其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用相關(guān)。
　　 結(jié)論：FOXO1在正常B細(xì)胞尤其是生發(fā)中心B細(xì)胞中高表達(dá)，在cHL的腫瘤成分HRS細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)。FOXO1的低轉(zhuǎn)錄水平與染色體缺失有關(guān)。而AKT/PKB和MEK的持續(xù)活性引起FOXO1 蛋白降解。在低表達(dá)FOXO1的cHL細(xì)胞系中，導(dǎo)入FOXO1基因可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并引起凋亡。