酶組化法和生化法在藥物安評(píng)中的效果比較及鹽酸雷諾嗪遺傳毒性研究.pdf

1、藥物毒性是導(dǎo)致藥物研發(fā)失敗的主要原因之一。為了避免在藥物開發(fā)晚期發(fā)現(xiàn)毒性導(dǎo)致的昂貴代價(jià)，盡早確定藥物潛在的毒性問題非常重要。在藥物毒性中，以肝和腎毒性最為重要。肝臟是生物轉(zhuǎn)化和解毒的主要場(chǎng)所，也是毒性損傷的易感靶器官之一。據(jù)報(bào)道，藥源性肝病或肝損傷在藥物不良反應(yīng)中占10％-15％。因此藥物毒性的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)藥物研發(fā)就顯得至關(guān)重要。本課題旨在實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，以Beagle犬作為模型，以低分量褐藻多糖硫酸酯(Low Molecular Wei

2、ght Fucoidan，LMWF)為研究對(duì)象，采用不同的檢測(cè)方法，檢測(cè)肝臟敏感指標(biāo)的變化，對(duì)毒性早期反應(yīng)進(jìn)行判斷，分析藥物產(chǎn)生毒性的可能性，提高重要臟器敏感指標(biāo)預(yù)測(cè)毒性的準(zhǔn)確性。
　　 1.酶組化法和生化法在藥物安評(píng)中的效果比較
　　 目的：觀察LMWF對(duì)Beagle犬肝臟血清生化及酶組織化學(xué)的影響。方法：(1)動(dòng)物分組和給藥：取健康Beagle犬16只，♀♂各半，按體重隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組(Veh)、LMWF低(L，2

3、00 mg/kg/d)、中(M，800 mg/kg/d)、高(H，3000 mg/kg/d)劑量組，每組4只。采用灌胃給藥方式，每天上午給藥1次，連續(xù)給藥6 d后，停藥1 d。按此方式，共計(jì)給藥13 wk。(2)指標(biāo)檢測(cè)：每天進(jìn)行一般癥狀觀察，每周測(cè)定體重1次；檢測(cè)第一次給藥前及末次給藥后的動(dòng)物血清生化指標(biāo)；末次給藥后，取肝臟稱重，計(jì)算臟器系數(shù)；在肝臟相同位置取1cm3大小組織，放入液氮速凍，切片、染色，進(jìn)行酶組織化學(xué)檢測(cè)；剩余肝臟用4

4、％中性甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡檢查。結(jié)果：(1)一般癥狀：LMWF各劑量組與Veh組動(dòng)物于給藥前和試驗(yàn)階段均未出現(xiàn)異常癥狀，動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài)良好，飲食、飲水正常。(2)體重：試驗(yàn)結(jié)果表明，在給藥期間，LMWF不同劑量組動(dòng)物的體重與Veh組比較，未見明顯改變(P>0.05)。(3)血清生化學(xué)檢測(cè)：給藥前和給藥結(jié)束，LMWF給藥各組動(dòng)物的相關(guān)血清生化指標(biāo)與Veh組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(4)病理學(xué)檢測(cè)：各

5、給藥組動(dòng)物的肝臟濕重和臟器系數(shù)與Veh組比較，未見明顯變化(P>0.05)；光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，各給藥組動(dòng)物肝臟的組織形態(tài)并未發(fā)現(xiàn)明顯病變。(5)肝臟 ATPase(adenosine triphosphatase，ATPase)和SDH(Succinate dehydrogenase，SDH)無論是定性觀察還是定量分析，3000 mg/kg/d給藥酶活性下降明顯，與Veh組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：LMWF給藥13

6、 wk，(1)動(dòng)物一般狀況良好，其活動(dòng)、飲食、飲水和體重增長(zhǎng)正常，常規(guī)臨床檢測(cè)未見與藥物相關(guān)的異常變化。(2)酶組織化學(xué)檢測(cè)，LMWF3000 mg/kg/d給藥ATPase和SDH活性明顯減弱，說明此劑量給藥對(duì)肝臟線粒體功能有影響，同時(shí)也表明酶組化方法比生化方法敏感。
　　 2.鹽酸雷諾嗪遺傳毒性試驗(yàn)研究
　　 目的：通過研究鹽酸雷諾嗪(Ranolazine，RZ)的遺傳毒性，評(píng)價(jià)其藥物安全性。方法采用Ames試驗(yàn)、小

7、鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)，檢測(cè)鹽酸雷諾嗪的遺傳毒性。Ames試驗(yàn)選用兩種方法：直接法和代謝活化法。試驗(yàn)菌株為鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102，鹽酸雷諾嗪在試驗(yàn)中設(shè)6個(gè)劑量組((5000、2500、1000、500、250和125μg/皿)，同時(shí)設(shè)自發(fā)回復(fù)突變對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組：小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)，每項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)鹽酸雷諾嗪給藥組(222、111和55 m

8、g/kg)、陰性對(duì)照組(Veh)及陽(yáng)性對(duì)照組(CP40 mg/kg。結(jié)果鹽酸雷諾嗪在≤5000μg/皿所測(cè)劑量范圍內(nèi)，對(duì)TA97、TA98、TA100和TA102四種菌株，加入和不加入S9的各劑量組對(duì)四種菌株回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，且無劑量反應(yīng)關(guān)系；鹽酸雷諾嗪在55～222mg/kg劑量范圍內(nèi)，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核數(shù)及小鼠精子畸變率與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論鹽酸雷諾嗪在