乳酸菌群早期消化道定植的實驗與臨床研究.pdf

1、目的：雙歧桿菌和乳桿菌等乳酸菌是消化道內(nèi)最重要的生理性益生菌群,本研究通過建立雙歧桿菌和乳桿菌的實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR)檢測技術,對腸外營養(yǎng)幼兔腸道雙歧桿菌和乳桿菌的變化、不同分娩方式下健康新生兒腸道雙歧桿菌和乳桿菌的定植過程、先天性消化道畸形新生兒術后腸道雙歧桿菌和乳桿菌的定植過程進行系列研究. 材料與方法: 1.熒光定量PCR技術建立:根據(jù)雙歧桿菌和乳桿菌16sDNA

2、序列合成屬特異性引物,抽提雙歧桿菌和乳桿菌凍干菌粉中細菌組DNA,應用引物擴增特異性目標片斷,經(jīng)轉染、克隆制備外標準品,系列稀釋后進行實時熒光定量PCR擴增,獲取標準曲線,分析特異性、敏感性、重復性,并對已知濃度樣品和未知濃度糞便樣品進行驗證性分析. 2.外源性雙歧桿菌對PN幼兔腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的影響:生后2周的新西蘭種白兔分為對照組、PN組和PN+雙歧桿菌組.對照組母乳喂養(yǎng),PN組每日經(jīng)頸靜脈插管連續(xù)24h輸入營養(yǎng)

3、液(210kcal/kg/d)；PN斗雙歧組在輸入和PN組等熱量營養(yǎng)液同時,每日經(jīng)胃管給予雙歧桿菌活菌0.5×10<'8>.實驗第10d,對幼兔糞便進行雙歧桿菌和乳桿菌定量分析. 3.不同分娩方式下母乳喂養(yǎng)新生兒腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的研究:以2006年1月至2006年12月于我院出生的陰道分娩和剖腹產(chǎn)分娩的健康足月母乳喂養(yǎng)新生兒各20例為觀察對象,連續(xù)檢測其生后7天糞便內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量. 4.先天性消化道

4、畸形新生兒術后腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的研究:以2006年1月～2007年2月我院兒外科連續(xù)收治的12例先天性食道閉鎖和先天性小腸閉鎖新生兒作為研究對象,連續(xù)檢測其住院期間糞便內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量,并記錄相關臨床資料,分析影響其腸道定植的可能因素. 結果： 1.熒光定量PCR技術建立:應用屬特異性引物作常規(guī)PCR,電泳顯示雙歧桿菌擴增條帶為1428bp,乳桿菌擴增條帶為600bp,陰性對照大腸桿菌未見擴增條帶,說

5、明所用引物能準確鑒別雙歧桿菌和乳桿菌；梯度稀釋外標準品后進行Real-time PCR擴增獲得6濃度梯度的標準曲線,回歸系數(shù)r>0.99,靈敏度達10<'2>,復孔擴增顯示重復性良好,擴增產(chǎn)物溶解曲線顯示單峰,說明產(chǎn)物單一.已知濃度樣品檢測結果精確,糞便樣品檢測結果均成陽性. 2.外源性雙歧桿菌對PN幼兔腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的影響:PN組幼兔雙歧桿菌和乳桿菌含量(log拷貝數(shù)/0.05g濕糞)分別為4.62±0.24和4

6、.29±0.49,顯著低于對照組 (分別為5.84±0.92,5.14±1.07,P<0.01) 和雙歧組(6.41±0.39,5.46±0.61,P<0.01)；雙歧組兩菌含量略高于對照組,但差異無顯著性(P>0.05). 3.不同分娩方式下母乳喂養(yǎng)新生兒腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的研究:生后一周內(nèi)陰道分娩組雙歧桿菌數(shù)量(10g拷貝數(shù)/g濕糞)由5.1升至9.3,剖腹產(chǎn)組由低于4.6的檢測低限值升至8.7,兩組差異顯著(P<

7、0.05),剖腹產(chǎn)組有6例新生兒生后第2天雙歧桿菌檢測陰性；陰道分娩組乳桿菌數(shù)量由4.9升至7.2,剖腹產(chǎn)組由4.9升至6.9,兩組差異無顯著性(P>0.05). 4.先天性消化道畸形新生兒術后腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的研究:雙歧桿菌定植時間為生后13天,乳桿菌為12天；雙歧桿菌和乳桿菌定植時間隨抗生素應用時間不同而變化.雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量在患兒達到全腸內(nèi)喂養(yǎng)后出現(xiàn)一個較快的增長期,乳桿菌增殖速度較雙歧桿菌快,出院時患兒腸

8、道內(nèi)雙歧桿菌平均水平(10g拷貝數(shù)儋濕糞)為6.05,乳桿菌平均水平為7.01. 小結: 1.應用實時熒光定量PCR技術能對糞便樣品內(nèi)的雙歧桿菌和乳桿菌做精確定量分析. 2.PN導致幼兔腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量減少；外源性雙歧桿菌干預后可提高PN幼兔腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量. 3.剖腹產(chǎn)對健康足月母乳喂養(yǎng)新生兒腸道內(nèi)雙歧桿菌定植的影響大于對乳桿菌的影響. 4.先天性消化道畸形新生兒術后腸道雙歧