新型生物分子固定技術(shù)用于構(gòu)建生物傳感器的研究.pdf

1、長(zhǎng)期以來，由于電化學(xué)生物傳感器具有設(shè)計(jì)制造簡(jiǎn)單、靈敏度高、價(jià)格低廉、選擇性好、所需儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，己被廣泛研究并逐漸應(yīng)用于食品工業(yè)、環(huán)境檢測(cè)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。然而，如何將生物活性組分有效地固定在電極表面上的固定化方法、降低甚至消除蛋白質(zhì)在傳感器上的非特異性吸附等方面存在的問題阻礙了電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展和應(yīng)用。本論文正是基于以上考慮，設(shè)計(jì)了一系列新型生物分子固定技術(shù)，結(jié)合各種電化學(xué)方法，研究了蛋白質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)并制備了相應(yīng)的生物

2、傳感器。 本文第一部分研究了基于電子媒介體的酶生物傳感器。1.利用能保持生物分子活性、增大電極比表面積進(jìn)而增大生物分子負(fù)載量的納米金溶膠作為固酶基質(zhì)，以溶膠-凝膠法固定辣根過氧物酶于電聚合普魯士藍(lán)膜修飾鉑盤電極表面，制備基于電子媒介體的第二代酶生物傳感器。功能化溶膠-凝膠的引入，不僅能增大納米金及酶分子的固定量，而且能有效地防止易溶性小分子媒介體的滲漏。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器在H2O2濃度為7.0×10-6～6.6×10-3m

3、ol·L-1范圍內(nèi)有線性響應(yīng)，檢出限為3.0×10-6mol·L-1。 2.首次電聚合鄰氨基苯甲酸于玻碳電極表面，使其形成帶負(fù)電的界面，通過靜電作用自組裝一層帶正電荷的電子媒介體甲苯胺藍(lán)，利用媒介體的氨基吸附納米金，最后靜電吸附固定辣根過氧化物酶制備過氧化氫傳感器。探討了膜聚合時(shí)間、媒介體組裝時(shí)間、pH、溫度、工作電位等對(duì)電極響應(yīng)的影響。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器對(duì)H2O2電流響應(yīng)與其濃度在1.5×10-5～1.3×10-3m

4、ol·L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為5.6×10-6mol·L-1。該法制備的傳感器具有較低的工作電位，能有效地消除抗壞血酸等的干擾。 本文第二部分研究了蛋白質(zhì)直接電化學(xué)的第三代生物傳感器。 通過靜電吸附作用將多層細(xì)胞色素c和納米金固定在聚鄰氨基苯甲酸膜表面，制成穩(wěn)定的多層蛋白膜修飾電極，研究了細(xì)胞色素c在該電極上的直接電化學(xué)行為。固載細(xì)胞色素c的修飾電極在pH6.5的磷酸鹽緩沖液中有一對(duì)相當(dāng)可逆的循環(huán)伏安氧化還原峰。

5、應(yīng)用于過氧化氫的電催化還原，固定在電極上的多層細(xì)胞色素c表現(xiàn)出穩(wěn)定且較高的催化活性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過改變組裝層數(shù)控制固定在電極上細(xì)胞色素c的量，可提高該傳感器的靈敏度和檢測(cè)范圍。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，H2O2濃度在9.8×10-8～1.3×10-3mol·L-1范圍內(nèi)與其還原峰電流呈線性關(guān)系，檢出限為6.6×10-8mol·L-1。本文第三部分研究了新型酶放大電流響應(yīng)信號(hào)的免疫傳感器。 1.利用靜電吸附固定在聚對(duì)氨基苯磺酸膜中的甲苯胺

6、藍(lán)媒介體結(jié)合納米金，再固定癌胚抗體后，利用分子量相近的辣根過氧化物酶代替牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，制得性能優(yōu)良的新型免疫傳感器。探討了過氧化物酶取代牛血清白蛋白作為封閉劑的可行性、過氧化物酶的電流放大效應(yīng)、陰離子前驅(qū)體的選擇、甲苯胺藍(lán)吸附時(shí)間、H2O2濃度、溶液pH等對(duì)此免疫傳感器的影響。實(shí)驗(yàn)表明：由本法制備的新型免疫傳感器無需酶標(biāo)抗原或抗體；過氧化物酶在封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)的同時(shí)就能擴(kuò)大電極的電流響應(yīng)信號(hào)，從而使免疫傳感器獲得

7、比同類文獻(xiàn)更高的檢測(cè)靈敏度。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，用循環(huán)伏安法測(cè)得癌胚抗原的線性范圍為0.5～5和5～120ng·mL-1，檢出限為0.2ng·mL-1。 2.采用自組裝技術(shù)和靜電吸附作用，將甲胎蛋白抗體固定在多層辣根過氧化物酶/納米金及L-半胱胺酸修飾的金電極表面，制得無試劑型免疫傳感器。考察了電極的電化學(xué)特性，并對(duì)該免疫傳感器的作用機(jī)理及性能進(jìn)行了詳細(xì)研究。該法無需對(duì)抗原(或抗體)進(jìn)行標(biāo)記，簡(jiǎn)化了免疫傳感器的制備過程；采用納米金和