Rb和p21在嬰幼兒血管瘤的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：探討Rb和p21在嬰幼兒皮膚血管瘤自然退化過程的可能作用及機(jī)制，為臨床尋找血管瘤的治療新方法提供理論指導(dǎo)。 方法：收集瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科2003年8月至2005年11月間手術(shù)切除的嬰幼兒皮膚血管瘤標(biāo)本54例、血管畸形標(biāo)本22例(部分標(biāo)本為瀘醫(yī)附院病理科存檔血管畸形石臘塊)以及相應(yīng)的臨床資料。所有患者術(shù)前均未接受任何可能引起Rb、p21WAF1/CIP1抗原改變的放射治療、化學(xué)治療及免疫治療等。取材后的標(biāo)本經(jīng)10％甲

2、醛固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋制成蠟塊，4μm連續(xù)石蠟切片。HE染色后進(jìn)行病理復(fù)檢，按Mulliken標(biāo)準(zhǔn)將血管瘤分為增生期血管瘤(A組28例)和退化期血管瘤(B組26例)，另取瘤體周圍正常皮膚10例作為對照。采用免疫組織化學(xué)鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(Streptavidinproxidaseimmunohistochemistrymethod，S-P法)檢測Rb、p21WAF1/CIP1及增殖細(xì)胞核抗原(Proliferati

3、ngcellnuclearantigen，PCNA)表達(dá)情況，并用末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)-生物素頸端標(biāo)記法(Terminaldeoxynucleotidy1transferasemediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)檢測其血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendotheliacell，VEC)凋亡情況。采用已知免疫組化染色陽性的小細(xì)胞肺癌組織切片(由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提

4、供)作為染色陽性對照標(biāo)準(zhǔn)，用PBS代替一抗作為陰性對照標(biāo)準(zhǔn)。以血管瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜、胞核或胞漿呈黃色至棕黃色為Rb、p21及PCNA表達(dá)的陽性細(xì)胞。參照盧曉曄等的方法，每間隔一個(gè)高倍視野選取一個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)切片至少觀察5個(gè)高倍視野。根據(jù)1996年《全國免疫組織化學(xué)技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研究會(huì)》的標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)染色強(qiáng)度和顯色細(xì)胞的比例將染色結(jié)果分為“，+，++，+++”4級(jí)：陽性細(xì)胞數(shù)＜10％為陰性(-)，10～25％為弱陽性(+)，2

5、5％～50％為陽性(++)，＞50％為強(qiáng)陽性(+++++)。凋亡細(xì)胞的原位檢測：原位標(biāo)記凋亡細(xì)胞核中的DNA片斷3-OH末端，以細(xì)胞核呈黃色為凋亡細(xì)胞。光鏡下每例切片觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)及凋亡指數(shù)(AI)。凋亡指數(shù)(AI)=[染色陽性細(xì)胞數(shù)(10個(gè)高倍視野中)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)(100×10)]×100％。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS(12.0版)軟件，凋亡指數(shù)均值采用(x)±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用

6、t檢驗(yàn)，P＜0.01為有顯著性意義。其他數(shù)據(jù)進(jìn)行X2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：①Rb抗原陽性物質(zhì)主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，部分胞漿著色。在退化期血管瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜中可見有大量的Rb抗原表達(dá)，而在增生期血管瘤和血管畸形組中幾乎無表達(dá)。Rb抗原陽性表達(dá)率在退化期血管瘤為76.92％，在增生期血管瘤和血管畸形中分別為28.57％和18.18％。Rb抗原在退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)與在增生期血管

7、瘤和血管畸形中的表達(dá)差異有顯著性(P＜0.05)。②p21WAF1/CIP1陽性物質(zhì)主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿或胞核。在退化期血管瘤中p21WAF1/CIP1的表達(dá)明顯，在增生期血管瘤和血管畸形中表達(dá)均較弱。P21WAF1/CIP1陽性表達(dá)在血管瘤增生期、退化期和血管畸形中分別為21.43％、65.38％和22.73％，退化期組的陽性表達(dá)高于增生期組和血管畸形組(P＜0.05)。③PCNA陽性表達(dá)的細(xì)胞在光鏡下可見核內(nèi)彌漫分布細(xì)小的棕黃

8、色顆粒。增生期血管瘤這些PCNA陽性表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞形成無腔的細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞索，細(xì)胞間結(jié)締組織極少，細(xì)胞界限不清，核肥大淡染、形態(tài)大小各異、呈橢圓形、三角形或水滴狀等，可見核分裂相；部分瘤體的細(xì)胞團(tuán)、索內(nèi)出現(xiàn)管腔，形成新的毛細(xì)血管，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)與管腔大小不成比例。28例增生期血管瘤中有20例見PCNA陽性表達(dá)，其中強(qiáng)陽性表達(dá)7例，陽性率為78.57％；退化期血管瘤PCNA表達(dá)明顯減少，且呈弱陽性表達(dá)。瘤體以血管為主，形成大量毛細(xì)血管腔，毛細(xì)血

9、管管腔明顯擴(kuò)大，管壁內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少；血管外已無細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞索，血管間結(jié)締組織明顯增多，血管間距增大。26例退化期血管瘤中見8例表達(dá)，陽性率為30.77％；血管畸形的PCNA陽性細(xì)胞較少，表達(dá)呈弱陽性，瘤體由密集排列、異常擴(kuò)張的血管組成，血管內(nèi)皮細(xì)胞為扁平狀，呈單層排列，無異常增生現(xiàn)象；血管管腔大小不等，管壁周圍有結(jié)締組織包繞。22例血管畸形中有4例表達(dá)，陽性率為18.18％。增生期血管瘤組與退化期血管瘤組和血管畸形組比較差異有顯著性(

10、P＜0.05)。④光鏡下可見增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增生活躍，形成內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞索，血管腔被阻塞，血管呈叢狀或小葉狀分布，采用TUNEL法染色后僅見少量散在分布的凋亡細(xì)胞；退化期血管瘤組織內(nèi)細(xì)胞成分減少，可見散在呈島狀分布的脂肪和纖維組織，此期可見大量的細(xì)胞凋亡；血管畸形的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈單層扁平狀排列，管腔大小不等，無異常增生現(xiàn)象，此期見少量的細(xì)胞凋亡。增生期血管瘤組凋亡指數(shù)均值為：2.268±0.714，退化期血管瘤組凋亡指數(shù)均值為：2

11、3.697±11.756，血管畸形組凋亡指數(shù)均值為：1.346±0.583。血管瘤退化期細(xì)胞凋亡顯著增加，與增生期和血管畸形比較差異顯著(P＜0.01，t值分別為5.638和5.825)。 結(jié)論：①在血管瘤退化的自然過程中，存在著逐漸活躍的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡在血管瘤的退化機(jī)制中可能起著重要作用。②血管瘤是以血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為生物學(xué)特征。PCNA可作為血管瘤分類和分期的客觀標(biāo)志物。PCNA的檢測也為血管瘤臨床治療效果的比較和研

12、究提供了較為客觀的指標(biāo)。③Rb及p21WAF1/CIP1參與了嬰幼兒皮膚血管瘤增生與退化的過程，其表達(dá)和激活與血管瘤的自然退化有著密切的關(guān)系。其機(jī)制可能與Rb和/或p21WAF1/CIP1介導(dǎo)和調(diào)控血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。④抑癌基因Rb以其低磷酸化型的p105Rb與促進(jìn)細(xì)胞分裂的轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合形成復(fù)活物，阻止E2F對c-myc、c-fos、TGF-β等基因轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞周期進(jìn)行，使其停留在G1期。生長抑制蛋白p21WAF1/CIP1

13、是各種細(xì)胞周期素依賴激酶的有效抑制物，p21與cyclin、CDK和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)形成一個(gè)四聯(lián)復(fù)合物，抑制野生型p53細(xì)胞中G1期向S期轉(zhuǎn)換，引起細(xì)胞周期阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過誘導(dǎo)Rb和/或p21WAF1/CIP1表達(dá)，使用Rb和/或p21WAF1/CIP1配體來誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，或用反義CyclinD1阻斷細(xì)胞周期，用野生型p53取代突變型，用Rb單克隆技術(shù)等，均可能促進(jìn)血管瘤消退，縮短血管瘤的自然退化病程。