嬰幼兒血管瘤病程相關(guān)microRNAs的篩選和作用研究.pdf

1、嬰幼兒血管瘤(Infantile hemangiomas,IH)是嬰幼兒最常見(jiàn)的軟組織腫瘤,高加索人種發(fā)病率在4-12％之間,亞洲人種發(fā)病率在1％左右,女?huà)胂鄬?duì)高發(fā),男女比例為1:3-4,早產(chǎn)低體重兒發(fā)病率明顯升高。嬰幼兒血管瘤一般在出生后數(shù)天或數(shù)周內(nèi)即進(jìn)入增生期表現(xiàn)為瘤體快速增殖,持續(xù)數(shù)周或數(shù)月后轉(zhuǎn)入平臺(tái)期,隨后進(jìn)入數(shù)年緩慢自發(fā)性的消退期,這種自然病程是IH的重要特征。雖然多數(shù)患兒的瘤體能夠消退完全,但多留有疤痕或脂肪沉積樣改變,增生

2、早期對(duì)瘤體的控制能夠減少殘留面積,同時(shí)約60％的IH瘤體發(fā)生于具有重要美學(xué)和生理功能的面頸部,以及仍有約20％的嬰幼兒血管瘤因其顯著的生長(zhǎng)性,或者侵犯、影響正常生理功能甚至威脅嬰幼兒生命而需要臨床及時(shí)治療,因尚無(wú)法預(yù)判患兒瘤體發(fā)展是否存在風(fēng)險(xiǎn)并需要特殊治療,故IH的早期干預(yù)治療越來(lái)越受到重視。但I(xiàn)H的具體發(fā)病機(jī)制仍然不明,臨床治療帶有一定的盲目性,因此IH的機(jī)制研究成為必要。目前的研究?jī)A向于IH來(lái)源于嬰幼兒血管瘤干細(xì)胞,具有未分化性表面

3、標(biāo)記物的不成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量增殖,是嬰幼兒血管瘤增殖期快速生長(zhǎng)的關(guān)鍵原因。多項(xiàng)研究表明VEGFR2信號(hào)通路的高活性狀態(tài)對(duì)IH增生期的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移中起到了關(guān)鍵的作用,而NF-kB信號(hào)通路,Notch信號(hào)通路對(duì)IH的影響與VEGF信號(hào)通路活性的增強(qiáng)有密切的聯(lián)系,臨床廣泛使用的糖皮質(zhì)激素和普萘洛兒治療IH的機(jī)制研究也與VEGF信號(hào)通路活性密切相關(guān)。IH臨床表現(xiàn)為增生期、平臺(tái)期和消退期,機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)平臺(tái)期是一種過(guò)度狀態(tài),是IH瘤

4、體主要增殖細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞逐漸停止增殖,并逐漸消失伴隨脂肪和纖維組織沉積的過(guò)度狀態(tài)。關(guān)于IH消退的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)凋亡在其中具有重要作用,同時(shí)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化和沉積可能也是消退的重要原因。但作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要調(diào)節(jié)因子microRNA在IH中的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此本課題旨在從microRNA在嬰幼兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用出發(fā),對(duì)IH的病程發(fā)展機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究,為更有效的指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 本課題主要研究

5、了以下內(nèi)容:
　　 第一部分:不同時(shí)期嬰幼兒血管瘤組織差異microRNA的芯片檢測(cè)和篩選
　　 實(shí)驗(yàn)方法本研究在抽提獲得臨床收集的臨床確診IH標(biāo)本總RNA基礎(chǔ)上,通過(guò)Affymetrix miRNA3.0芯片對(duì)典型增生早期,平臺(tái)期和消退期3例IH標(biāo)本的microRNA進(jìn)行檢測(cè),并通過(guò)miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)靶基因,在取兩者交集作為靶基因后,對(duì)基因進(jìn)行功能分析,篩選和IH相關(guān)功能基因構(gòu)建m

6、icroRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對(duì)獲取的不同時(shí)期IH組織標(biāo)本共9例,增生早期4例,平臺(tái)期3例,消退期2例,抽提總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,設(shè)計(jì)hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-130b-3p, hsa-miR-206, hsa-miR-371 a-5p, hsa-miR-373-3p, hsa-miR-455-5p莖環(huán)狀引物,采用SuperReal PreMix(SYBRGreen)試劑進(jìn)行reaitimePCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。實(shí)

7、驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以2-△△CT進(jìn)行量化分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果三例標(biāo)本芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行兩兩比較,差異倍數(shù)以3倍及以上作為差異microRNA入選標(biāo)準(zhǔn),共獲得差異microRNA有38個(gè),依疾病進(jìn)程下調(diào)的microRNA共22個(gè),上調(diào)microRNA共16個(gè)。獲得這些差異microRNA的預(yù)測(cè)靶基因共2463個(gè),基因功能GO-Analysis后,以IH疾病可能相關(guān)功能篩選得靶基因共540個(gè),以此構(gòu)建的microRNA與基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示處

8、于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的microRNA為: hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-130b-3p, hsa-miR-206, hsa-miR-371a-5p,hsa-miR-373-3p,hsa-miR-455-5p。9例標(biāo)本抽提總RNA質(zhì)檢合格,各microRNA引物設(shè)計(jì)符合要求,realtimePCR結(jié)果顯示,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-455-5p組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,hsa-miR-1

9、30b-3p,hsa-miR-371a-5p,hsa-miR-373-3p組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 第二部分:嬰幼兒血管瘤來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　 實(shí)驗(yàn)方法:獲取經(jīng)確診的IH增生早期手術(shù)后標(biāo)本,消毒處理后第一時(shí)間于4℃條件下以分散酶作用24h,去除表皮碎化組織后以膠原酶于37℃下作用40min,隨后進(jìn)行細(xì)胞過(guò)濾,過(guò)濾后單細(xì)胞懸液以CD31偶聯(lián)磁珠結(jié)合后經(jīng)磁珠分選儀分選。分選后細(xì)胞以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為對(duì)照,進(jìn)行細(xì)

10、胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定,細(xì)胞吞脂實(shí)驗(yàn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)、CD31和vWF抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:IH血管內(nèi)皮細(xì)胞分選條件良好,可獲得較充分的細(xì)胞量,分選后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,增殖能力自培養(yǎng)第三天后較人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增長(zhǎng)更快;細(xì)胞吞脂實(shí)驗(yàn)顯示與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯差異;成管實(shí)驗(yàn)顯示與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞比較,IH來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞具備更快的成管能力,但成管較為雜亂;細(xì)胞免疫熒光染色顯示IH來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞

11、CD31和vWF抗體陽(yáng)性,所培養(yǎng)細(xì)胞陽(yáng)性率在92±3％。
　　 第三部分:hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-455-5p對(duì)嬰幼兒血管瘤來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究
　　 實(shí)驗(yàn)方法:以fam熒光標(biāo)記miR-67為轉(zhuǎn)染對(duì)照,單純轉(zhuǎn)染試劑為陰性對(duì)照,通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑將hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-455-5p的mimics或inhibitor轉(zhuǎn)染入IH來(lái)源血管內(nèi)

12、皮細(xì)胞,通過(guò)cck-8法檢測(cè)細(xì)胞活性反映細(xì)胞增殖能力改變,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平改變,transwell侵襲系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力改變,研究轉(zhuǎn)染前后目的microRNA對(duì)IH來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲能力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:fam熒光標(biāo)記miR-67顯示轉(zhuǎn)染條件良好,轉(zhuǎn)染效率近100％;和對(duì)照組比較,細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-29a-3p的mimics后48h增殖能力無(wú)明顯改變,轉(zhuǎn)染后48h出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)染24h后

13、侵襲能力無(wú)明顯改變,細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-29a-3p的inhibitor后48h細(xì)胞增殖凋亡與侵襲能力無(wú)明顯改變;和對(duì)照組比較,細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-206的mimics后48h增殖能力明顯減弱,轉(zhuǎn)染后48h出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)染24h后侵襲能力明顯減弱,細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-206的inhibitor后增殖與細(xì)胞凋亡無(wú)明顯改變,細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng);和對(duì)照組比較,細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-455-5p的mimics和inhibi

14、tor后48h增殖能力無(wú)明顯改變,轉(zhuǎn)染后48h無(wú)明顯細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)染24h后侵襲能力無(wú)明顯改變。
　　 本課題研究結(jié)論miR-29a-3p,miR-206,miR-455-5p在IH不同時(shí)期的nicroRNA表達(dá)譜中存在差異,這些差異miRNA可能參與了IH病程進(jìn)展多種相關(guān)功能調(diào)節(jié);miR-29a-3p可能通過(guò)改變IH血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡水平影響疾病進(jìn)程,特別是對(duì)IH的自發(fā)消退起到了重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用;miR-206可能通過(guò)改變I