哲羅鮭胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ原核表達(dá)、多克隆抗體的制備及組織表達(dá)分析.pdf

1、在魚類胚胎發(fā)育過(guò)程中，胰島素樣生長(zhǎng)因子-II（insulin-like growth factors-II，IGF-II）起著關(guān)鍵的作用。哲羅鮭（Hucho taimen）是鮭科魚類中最大的個(gè)體，其細(xì)嫩的肉質(zhì)、鮮美的味道具有很高的食用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于哲羅鮭的IGF-II基因的研究。本研究根據(jù)GenBank里收錄的鮭鱒魚IGF-II基因序列設(shè)計(jì)引物P1、P2，以哲羅鮭肝臟RNA提取物為模板，利用RT-PCR方法擴(kuò)增出哲羅鮭I

2、GF-II基因開放閱讀框。首先本研究利用生物學(xué)軟件對(duì)成功克隆出的哲羅鮭IGF-II基因開放閱讀框進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，其中利用MegAlign軟件中默認(rèn)的Clustal W模式對(duì)IGF-II核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。利用DNAMAN翻譯獲得IGF-II氨基酸序列，利用Protean軟件進(jìn)行IGF-II蛋白分子量及等電點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，采用Clustalx1.83軟件和MEGA5.0軟件構(gòu)建了IGF-II核酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。其次，

3、本研究根據(jù)哲羅魚IGF-II基因開放閱讀框序列，利用Primer軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)用于做熒光實(shí)時(shí)定量PCR的引物IGF-II-F、IGF-II-R，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法來(lái)檢測(cè)二齡哲羅鮭IGF-II基因在不同組織中的表達(dá)情況。最后本研究將目的基因IGF-II與原核表達(dá)載pSUMO連接構(gòu)建出重組表達(dá)載體pSUMO-IGF-II。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中利用IPTG進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)包涵體形式存在的原核表達(dá)蛋白進(jìn)行

4、變性/復(fù)性后獲得較純的目的蛋白，利用ELISA和MTT方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行免疫學(xué)活性及生物學(xué)活性分析。然后利用有生物活性和免疫活性的目的蛋白免疫小鼠，獲得鼠抗血清。利用ELISA方法檢測(cè)獲得的哲羅鮭IGF-II抗體的效價(jià)；本研究旨在為哲羅魚的生長(zhǎng)模式和生長(zhǎng)繁殖的研究奠定基礎(chǔ)。相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.克隆的哲羅鮭IGF-II基因的生物信息學(xué)與組織表達(dá)分析
　　克隆出的哲羅鮭的IGF-II基因開放閱讀框序列經(jīng)過(guò)測(cè)序后，用bl

5、ast和DNAMAN比對(duì)分析結(jié)果正確后，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)目的片段進(jìn)行分析，結(jié)果顯示哲羅鮭IGF-II基因的長(zhǎng)度為645bp，編碼的蛋白質(zhì)含有214個(gè)氨基酸殘基，該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為24.554kDa，等電點(diǎn)為9.92；哲羅鮭IGF-II前肽由信號(hào)肽、B、C、A、D、E六部分構(gòu)成；同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，哲羅鮭IGF-II與鮭科魚類IGF-II同源性最高，其中與大西洋鮭的IGF-II同源性最高（98％），該基因在進(jìn)化的過(guò)程

6、中有著高度保守的進(jìn)化特性；熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該基因在肝臟中的表達(dá)量最高，在心、鰓、脾、后腸、頭腎、胃中次之，而在前腸和腦中的表達(dá)量最低。
　　2.哲羅鮭IGF-II基因的原核表達(dá)、活性鑒定與抗體制備
　　將測(cè)序結(jié)果正確的目的片段與原核表達(dá)載pSUMO連接，經(jīng)PCR和Bsa I和BamH I雙酶切驗(yàn)證成功構(gòu)建出重組表達(dá)載體pSUMO-IGF-II，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Rosetta中后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，產(chǎn)生了N端

7、帶有SUMO標(biāo)簽的重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，約在40kD處含有清晰的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。并且檢測(cè)結(jié)果顯示目的蛋白是以包涵體形式存在的。然后利用8M的尿素進(jìn)行蛋白變性，2M的尿素復(fù)性，經(jīng)過(guò)透析純化后獲得高濃度的目的蛋白。利用ELISA對(duì)目的蛋白進(jìn)行免疫學(xué)活性分析。ELISA結(jié)果顯示該目的蛋白能夠與商品化的抗鮭鱒魚IGF-II的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，并且呈現(xiàn)抗原濃度依賴性，該結(jié)果說(shuō)明本研究獲得了具有良好免疫原性的IGF-II

8、蛋白；在利用MTT方法測(cè)定IGF-II蛋白對(duì)鯉（Cyprinus carpio）上皮細(xì)胞（Epitheliaoma Papulosum Cyprini，EPC）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）性腺細(xì)胞（Rainbow trout gonad，RTG-2）的增殖效果來(lái)鑒定IGF-II蛋白的生物學(xué)活性，結(jié)果顯示所表達(dá)的哲羅鮭IGF-II蛋白能夠有效的刺激EPC細(xì)胞和RTG-2細(xì)胞增殖。該結(jié)果表明利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的哲羅魚I