抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、目的：胰島素樣生長(zhǎng)因子－1(insulin－like growth factor-1，IGF-1)診斷試劑盒目前在國(guó)際上只有美國(guó)、德國(guó)等幾個(gè)國(guó)家生產(chǎn)，且價(jià)格及其昂貴，導(dǎo)致在國(guó)內(nèi)臨床上的應(yīng)用大大受限。本實(shí)驗(yàn)室曾選用多種載體制備IGF-1蛋白抗原，但效果不理想，蛋白得率均比較低，給進(jìn)一步制備IGF-1單克隆抗體及生產(chǎn)IGF-1診斷試劑盒帶來(lái)困難。為填補(bǔ)國(guó)內(nèi)IGF-1診斷試劑盒自主生產(chǎn)的空白，本實(shí)驗(yàn)室在既往實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，選用pET29a(

2、+)、pET32a(+)載體，表達(dá)并純化含有hIGF-1的重組蛋白，從而制備穩(wěn)定分泌抗hIGF-1單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的雜交瘤細(xì)胞系，并對(duì)其分泌的mAb進(jìn)行鑒定。 方法：1.采用PCR法，擴(kuò)增編碼hIGF－1前體cDNA的片段，通過(guò)雙酶切、膠回收純化、連接后得到pET29a(+)/hIGF-1、pET32a(+)/hIGF-1重組載體。2.分別將其轉(zhuǎn)化入工程菌BL21(DE3)中，經(jīng)異丙基

3、－β－D－硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化。3.用免疫印跡(Westernblot)法檢測(cè)重組蛋白的抗原活性。4.用純化后的hIGF-1重組蛋白免疫Balb/c小鼠，利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備抗hIGF-1的mAb。5.對(duì)mAb進(jìn)行鑒定，包括用Western blot法鑒定mAb的特異性，用間接酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunos