表達(dá)hCGβ-C3d3融合蛋白的乳酸桿菌活疫苗粘膜免疫增強(qiáng)抗hCGβ免疫效應(yīng)機(jī)制.pdf

1、本研究的目的是將含有融合基因hCGβ．C3d3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化干酪乳酸桿菌，對(duì)比表達(dá)hCGp的重組乳酸桿菌活疫苗Lb．hCGfl或Lb．hCGfl-C3d3經(jīng)不同粘膜途徑接種不同品系小鼠，產(chǎn)生抗hCGB免疫應(yīng)答，驗(yàn)證C3d3在表達(dá)hCGB重組乳酸桿菌活疫苗粘膜免疫中的佐劑作用；探討C3d3在表達(dá)hCGp重組乳酸桿菌活疫苗粘膜免疫中增強(qiáng)hCGβ免疫原性的效應(yīng)機(jī)制。 方法：用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒pIlac．hCGp．C3d3，電穿孔轉(zhuǎn)化

2、干酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)CECT5276，挑選轉(zhuǎn)化后的耐藥菌落，在含紅霉素的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0．5％乳糖誘導(dǎo)后，在不同時(shí)間取上清，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)hCGp，Westernblot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定融合蛋白。用108，109，1010個(gè)重組乳酸桿菌Lb．hCGfl或Lb．hCGβ．C3d3分別經(jīng)消化道、呼吸道和陰道粘膜接種6-8周齡雌性BALB／c和C57BL／6小鼠，3周后用相同劑量加強(qiáng)免疫一次

3、。間接ELISA檢測(cè)初次接種后2—8周血清和陰道灌洗液中抗hCGβIgG和IgA抗體滴度；以及抗血清中和hCG抗原的活性。用10lO個(gè)重組乳酸桿菌Lb．hCGp或Lb．hCGfl-C3d3分別經(jīng)口腔、鼻腔和陰道粘膜接種6-8周齡雌性BALB／c和C57BL／6小鼠，分離免疫小鼠脾、子宮、陰道中的淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析其B和T細(xì)胞的增殖情況，ELISpot分析其分泌抗hCGpIgG和IgA抗體的抗體分泌細(xì)胞克隆數(shù)。 結(jié)果：經(jīng)測(cè)序

4、質(zhì)粒構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)化成功的重組干酪乳酸桿菌在乳糖誘導(dǎo)下可分泌融合蛋白hCGD．C3d3。在不同品系的小鼠體內(nèi)109，1010Lb．hCG?可誘導(dǎo)相似的免疫應(yīng)答，而lO8誘導(dǎo)的抗體滴度較低。三種粘膜免疫途徑誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相似。加強(qiáng)免疫后109和1010Lb．hCGβ誘導(dǎo)的抗血清中和hCG抗原的能力>100ng／ml。陰道粘膜接種誘導(dǎo)的最高抗體滴度不低于、甚至優(yōu)于其他兩種粘膜接種途徑。用Lb．hCOfl-C3d3接種誘導(dǎo)的最高效價(jià)比Lb．hC

5、Gp高2—100倍，加強(qiáng)接種后抗血清能有效中和hCG抗原的生物學(xué)活性。重組乳酸桿菌至少可在BALB／c小鼠陰道粘膜內(nèi)存活3周。與Lb．hCGfl相比，Lb．hCGfl-C3d3粘膜接種后T和B細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(p<0．05)。脾臟內(nèi)IgG及IgA抗體分泌細(xì)胞個(gè)數(shù)在Lb．hCGfl或Lb．hCGfl-C3d3各種免疫途徑間無(wú)顯著差異(p>0．05)；但Lb．hCGfl-C3d3粘膜接種后子宮及陰道內(nèi)IgG及IgA抗體分泌細(xì)胞個(gè)數(shù)均顯著

6、高于Lb．hCGfl(p<0．05)。 結(jié)論：實(shí)現(xiàn)了重組乳酸桿菌Lb．hCGp-C3a3分泌性表達(dá)融合蛋白hCGβ—C3d3，培養(yǎng)4小時(shí)后O．5％乳糖誘導(dǎo)是重組菌表達(dá)hCGβ的優(yōu)化條件。重組乳酸桿菌活疫苗Lb．hCGβ可經(jīng)粘膜免疫誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的應(yīng)答能力與免疫劑量有關(guān)。陰道粘膜接種可能是一種誘導(dǎo)生殖道粘膜免疫的較好途徑。用表達(dá)hCGp重組乳酸桿菌活疫苗粘膜免疫不同品系小鼠，C3d3均能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)hCGp抗原的體液免疫應(yīng)