CpG寡核苷酸增強(qiáng)UPEC FimH疫苗粘膜免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：尿路感染（Urinary tract infections，UTIs）是臨床上的常見病、多發(fā)病，其主要致病菌為尿路致病性大腸桿菌（Uropathogenic Escherichia coli，UPEC）。FimH是UPECⅠ型菌毛亞單位，能識別宿主上皮細(xì)胞特異受體氨基多糖聚糖或糖氨基糖甙等，介導(dǎo)細(xì)菌粘附并侵入宿主細(xì)胞而致病。另外，F(xiàn)imH蛋白還能夠直接與細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合誘導(dǎo)固有性免疫反應(yīng)。以前的研究表明，F(xiàn)imH蛋白和質(zhì)粒全

2、身免疫后能有效誘導(dǎo)血清中特異性IgG類抗體的產(chǎn)生，而尿道中sIgA水平很低，但在對抗粘膜感染的抗體反應(yīng)中sIgA更為重要。
　　 粘膜免疫在防御細(xì)菌、病毒等病原體引起的腸道及呼吸道感染中起主要作用，是機(jī)體免疫防御的第一道屏障。粘膜免疫可以誘導(dǎo)局部粘膜產(chǎn)生sIgA、IgM、IgG保護(hù)性抗體，并可誘導(dǎo)其他部位的粘膜也產(chǎn)生sIgA。由于粘膜表面特殊的理化性質(zhì)使粘膜應(yīng)答的強(qiáng)度減弱，因此需要應(yīng)用免疫佐劑使少量的抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期、高效且

3、持久的免疫應(yīng)答。
　　 CpG寡核苷酸（CpG oligodeoxynucleoties，CpG ODN）作為一種新型佐劑，可被宿主天然免疫細(xì)胞的上的模式識別受體（PRRs）識別，主要是toll樣受體9（TLR9），誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞活化。如它能激活樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，分泌IL-12、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子。另外，CpGODN有粘膜佐劑活性及廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性，是一種高效新型的粘膜佐劑，可誘導(dǎo)產(chǎn)生

4、Th1型免疫應(yīng)答。作為新型粘膜佐劑，CpG ODN在增強(qiáng)抗原免疫保護(hù)作用、Th型別轉(zhuǎn)換、誘導(dǎo)全面的系統(tǒng)和粘膜免疫應(yīng)答方面具有諸多優(yōu)勢。
　　 本研究旨在將構(gòu)建好的FimH的真核表達(dá)質(zhì)粒和原核表達(dá)蛋白制備和提純后，與CpG進(jìn)行不同組合免疫小鼠，觀察不同組的小鼠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及CpG對FimH疫苗的免疫增強(qiáng)作用及其對小鼠粘膜感染的免疫保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1、質(zhì)粒的提取、鑒定及蛋白的純化：提取真核表達(dá)質(zhì)粒P

5、cDNA3.1-fimH、原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-fimH和CpG基序，酶切鑒定正確；原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-fimH轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.Coli BL-21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白FimH，SDS-PAGE、Western-blot鑒定、尿素濃度梯度純化、定量；
　　 2、動(dòng)物免疫：將制備的FimH質(zhì)粒、CpG質(zhì)粒、FimH蛋白經(jīng)滴鼻免疫BALB/c小鼠，第1組空白對照組（滴入PBS）、第2組PcDNA3.1-fimH

6、質(zhì)粒組、第3組pGEX-4T-2-FimH蛋白組、第4組CpG組、第5組CpG+PcDNA3.1-fimH質(zhì)粒組、第6組CpG+pGEX-4-2-FimH蛋白組，每組12只，每只100μl/次，共免疫四次，間隔14天；每次免疫前內(nèi)眥取血收集血清并收集尿液；
　　 3、血清中特異性IgG的效價(jià)測定：ELISA法測定外周血中抗FimH蛋白特異性IgG；
　　 4、尿液及血清中sIgA、IgA的效價(jià)測定：ELISA法測定尿液中

7、的sIgA和外周血中的IgA；
　　 5、以流式細(xì)胞儀測量淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+亞群的百分比含量；
　　 6、攻毒后膀胱中菌落計(jì)數(shù)：末次免疫后20天，留取血清及尿液，用大腸桿菌J96株對小鼠行經(jīng)尿道膀胱攻毒，菌量為108個(gè)/50μl，自小鼠尿道口注入50μl菌液/只。攻毒后2天處死小鼠，將膀胱懸液稀釋后涂布于伊紅美蘭平板培養(yǎng)基上，37℃溫箱孵育12小時(shí)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
　　 7、熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測膀胱組

8、織細(xì)胞因子IFN-γmRNA的表達(dá)量：攻毒后小鼠膀胱組織提取RNA，以反轉(zhuǎn)后cDNA為模板，IFN-γ的引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。
　　 結(jié)果：
　　 1、真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1-fimH、原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-fimH酶切后分別產(chǎn)生4970bp、903bp及5400bp、903bp兩個(gè)片段，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。尿素濃度梯度法純化出以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白FimH。
　　 2、經(jīng)鼻粘膜免疫小鼠，實(shí)

9、驗(yàn)組血清中均檢測出抗-FimH特異IgG，CpG+FimH質(zhì)粒組的最高效價(jià)達(dá)到1：1600，CpG+FimH白組的最高效價(jià)達(dá)到1：6400，蛋白免疫比質(zhì)粒免疫、CpG聯(lián)合免疫組比單純免疫組效價(jià)均升高明顯（p<0.05）；尿液和血清中均檢測出sIgA、IgA，CpG聯(lián)合免疫組較高；質(zhì)粒免疫組也能誘導(dǎo)脾臟中CD4+T細(xì)胞百分含量增加（p<0.05），與CpG聯(lián)合免疫組比較無明顯差異（p>0.05）。
　　 3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示

10、，CpG聯(lián)合免疫組膀胱組織細(xì)胞因子IFN-γ mRNA的表達(dá)量比單純組顯著升高（p<0.05）。
　　 4、攻毒后膀胱中菌落計(jì)數(shù)顯示，單純FimH質(zhì)粒和FimH蛋白免疫組膀胱中的菌落數(shù)明顯低于CpG和PBS免疫組（p<0.05），相應(yīng)CpG聯(lián)合免疫組膀胱中菌落數(shù)則又顯著低于單獨(dú)免疫組（p<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、FimH的原核表達(dá)蛋白經(jīng)鼻粘膜免疫后能誘導(dǎo)血液和尿液中特異性抗體的產(chǎn)生，不能誘導(dǎo)較好的細(xì)