CpG寡核苷酸和霍亂毒素聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的弓形蟲特異性免疫應(yīng)答.pdf

1、目的：確定CpG寡核苷酸(CpGoligonucleotide，CpGODN)作為可溶性速殖子抗原(solubletachyzoiteantigen，STAg)的最佳劑量，觀察最佳劑量的CpGODN和STAg鼻內(nèi)免疫小鼠所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間，以及CpGODN和霍亂毒素(choleratoxin，CT)聯(lián)合佐劑的協(xié)同作用，弓形蟲復(fù)合黏膜疫苗研制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：第一部分：5～6周齡BALB/c小鼠50只隨機(jī)分為5組

2、，每組10只，實(shí)驗(yàn)組以0、1、5、10μg的CpGODN聯(lián)合20μgSTAg滴鼻免疫小鼠，對(duì)照組以PBS滴鼻，間隔2周免疫2次。末次免疫后30d處死全部小鼠，觀察脾、Peyer’spatch(PP)、腸系膜淋巴結(jié)(MLN)和IEL淋巴細(xì)胞增殖情況。檢測(cè)血清IgG和糞便IgA含量。 第二部分：雌性BALB/c小鼠72只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組36只。實(shí)驗(yàn)組以10μgCpGODN聯(lián)合20μgSTAg滴鼻免疫，對(duì)照組以PBS滴鼻。

3、間隔2周免疫2次，于末次免疫后第1、2、3、4、5、6周分別隨機(jī)處死小鼠(6只/組)。測(cè)定小腸沖洗液、鼻咽沖洗液、肺沖洗液、陰道沖洗液IgA和血清IgG。分離脾和IEL進(jìn)行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。 第三部分：5～6周齡BALB/c小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和PBS對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別用20μgSTAg、20μgSTAg+10μgCpGODN、20μgSTAg+1μgCT、20μgSTAg+1μgCT+10μgCpGODN滴鼻免

4、疫，間隔2周免疫2次。對(duì)照組用PBS以相同程序免疫。末次免疫后第20d處死小鼠。收集血清和腸沖洗液，用ELISA法檢測(cè)血清弓形蟲特異性IgG和腸液IgA含量。分離脾淋巴細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖活性。 結(jié)果：不同劑量的CpGODN聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠后，10μgCpGODN組小鼠腸相關(guān)淋巴組織PP、MLN和IEL以及脾淋巴細(xì)胞增殖明顯(P＜0.05)。10μg組血清IgG遠(yuǎn)高于對(duì)照組(P＜0.05)，糞便IgA高于對(duì)照

5、組(P＞0.05)。 10μgCpGODN聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠后脾淋巴細(xì)胞和IEL增生明顯。脾淋巴細(xì)胞在第2、3、4、5周顯著高于對(duì)照組(P＜0.001)。IEL數(shù)量分別在第2、4周出現(xiàn)兩個(gè)峰值，第2、3、4周顯著高于對(duì)照組(P＜0.001)。實(shí)驗(yàn)組小鼠各沖洗液中IgA平均水平高于對(duì)照組。小腸沖洗液中弓形蟲特異性IgA抗體水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，第2、3周(P＜0.001)，4周(P＜0.05)有顯著差異

6、。鼻咽沖洗液中IgA水平在第1周時(shí)最高，各時(shí)間點(diǎn)雖高于對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺沖洗液IgA在第5周達(dá)到高峰，第4、5、6周高于對(duì)照組(P＜0.001)。陰道沖洗液IgA在免疫后第1～6周顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，第5周時(shí)水平最高。實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG在第1周即顯著高于對(duì)照組(P＜0.001)，在之后的4周內(nèi)呈持續(xù)增高趨勢(shì)，至第6周出現(xiàn)下降。 STAg聯(lián)合CpGODN和/或CT滴鼻免疫小鼠后的血清IgGOD值、小腸沖洗液中

7、IgA以及脾淋巴細(xì)胞的體外特異性刺激指數(shù)(SI)較PBS對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)。加CpGODN和CT佐劑的實(shí)驗(yàn)組小腸沖洗液中IgA和脾淋巴細(xì)胞的SI顯著高于加CpGODN佐劑的實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。 結(jié)論：CpGODN可作為STAg的黏膜佐劑，10μgCpGODN與STAg聯(lián)合具有最佳的免疫效果。STAg/10μgCpGODN滴鼻免疫BALB/c小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生小腸沖洗液、鼻咽沖洗液、肺沖洗液、陰道沖洗液特異性IgA及血