硫代謝相關(guān)酶的生化分析.pdf

1、硫是植物生長所必需的大量元素之一。植物通過根系吸收土壤中的硫酸鹽，在胞內(nèi)首先經(jīng)ATP硫酸化酶活化為腺苷5'-磷酰硫酸(adenosine5'-phosphosulfate，APS)。APS的進(jìn)一步代謝包括初級代謝和次級代謝，分別是APS還原酶催化APS生成亞硫酸鹽，腺苷5'-磷酰硫酸激酶(adenosine5'-phosphosulfate kinase，APSK)催化APS磷酸化生成3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(3'-phosphoa

2、denosine5'-phosphosulfate，PAPS)，PAPS進(jìn)一步作為硫酸根的供體參與胞內(nèi)的硫酸化反應(yīng)，生成副產(chǎn)物3'，5'二磷酸腺苷酸(3'，5'-biphosphate adenosine，PAP)。
　　近年來的研究表明，擬南芥APSK在調(diào)節(jié)硫的初級和次級代謝的過程中具有重要功能，且受氧化脅迫的APSK1在C86和C119之間形成二硫鍵降低其催化活性。水稻的同工酶是否也會受到氧化還原調(diào)控尚無相關(guān)報道。通過對APS

3、K序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)水稻APSK1含有與擬南芥APSK C86和C119同源的半胱氨酸。本研究對水稻APSK1進(jìn)行了基因克隆、突變和酶活分析。利用RT-PCR，獲得了APSK1基因。通過經(jīng)原核表達(dá)、純化獲得APSK1及其雙突變蛋白C36A/C69A。體外酶活分析表明，在氧化環(huán)境中APSK1活性受到抑制，而C36A/C69A雙突變蛋白不受氧化環(huán)境的影響。結(jié)合模擬的三維結(jié)構(gòu)，我們推測水稻APSK第36位與第69位半胱氨酸之間可形成二硫鍵，而

4、水稻受到氧化脅迫時可降低APSK活性，促進(jìn)硫合成GSH提高水稻的抗氧化能力。
　　3'，5'二磷酸核苷酸酶（3'，5'-bisphosphate nucleotidase）催化PAP和PAPS的3'磷酸水解生成AMP和APS，是胞內(nèi)硫代謝的重要調(diào)控者之一。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)3'，5'二磷酸核苷酸酶可提高植物抗鹽性。酵母3'，5'二核苷酸酶亦稱為HAL2，參與細(xì)胞硫代謝和抗鹽過程。HAL2活性的改變可調(diào)節(jié)胞內(nèi)PAP濃度，從而影響磺基轉(zhuǎn)

5、移酶，?；d體蛋白合酶和RNA加工酶的活性[1]，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長發(fā)育。
　　本實驗室的前期工作表明，HAL2突變蛋白G236V對PAP有較高的催化效率（1.5×107 M-1·s-1），而對PAPS有極低的催化效率（2.6×103 M-1·s-1）。本文通過在大腸桿菌細(xì)胞中過量表達(dá)G236V分析其對細(xì)胞的影響，與預(yù)期結(jié)果相反，我們發(fā)現(xiàn)在無還原性硫存在的培養(yǎng)基中，G236V較HAL2的表達(dá)極大降低了細(xì)胞的生長速度。HAL2和G2

6、36V可水解1，6二磷酸果糖(fructose1，6-bisphosphate，F(xiàn)BP)，是PAP水解的競爭性抑制劑?；钚苑治霭l(fā)現(xiàn)G236V在高濃度FBP的情況下，較HAL2具有更高的水解FBP活性。我們推測G236V對胞內(nèi)FBP的大量水解是降低細(xì)胞生長的主要原因。丙酮酸鈉作為碳源的實驗表明，其不能恢復(fù)G236V過表達(dá)引起的細(xì)胞生長速率降低，我們推測丙酮酸鈉不是大腸桿菌的優(yōu)質(zhì)碳源是導(dǎo)致此結(jié)果的原因。所以我們認(rèn)為G236V通過降解1，6二

7、磷酸果糖，影響了細(xì)胞的能量代謝，從而降低了細(xì)胞的繁殖速度。
　　為進(jìn)一步驗證此假設(shè)，我們構(gòu)建了大腸桿菌HAL2同源蛋白CysQ(V152，功能與G236V相當(dāng))及其突變體V152G（功能與HAL2相當(dāng)）的表達(dá)載體。與上述結(jié)果相反，V152G在大腸桿菌中的過量表達(dá)降低了細(xì)胞的生長速度。進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)FBP對CysQ與V152G水解PAPS抑制能力相當(dāng)，他們水解FBP的能力也相當(dāng);而V152G(Km=24.18μM)較CysQ(

8、Km=35.31μM)對PAPS具有更強(qiáng)的親和力，所以V152G的過表達(dá)將有效降低PAPS含量及硫的還原速度，從而可能降低細(xì)胞生長繁殖。
　　綜上所述，本論文克隆分析了氧化還原條件對水稻APSK的功能調(diào)控，以及3'，5'二磷酸核苷酸酶的點突變對其活性及生理功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化條件，可促進(jìn)水稻APSK分子間二硫鍵的形成，降低其磷酸化APS的能力;HAL2較其突變體G236V具有較低的水解FBP水解能力，較高的PAPS水解能力;C