幾種海洋經(jīng)濟(jì)動物種質(zhì)資源超低溫冷凍保存研究.pdf

1、種質(zhì)資源是海水養(yǎng)殖生產(chǎn)、優(yōu)良品種培育及海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，海洋動物核心種質(zhì)鑒定和保護(hù)研究嚴(yán)重滯后的負(fù)面效應(yīng)日益突出。超低溫保存技術(shù)是種質(zhì)細(xì)胞長期保存的重要方法，相關(guān)理論與技術(shù)的發(fā)展，對于種質(zhì)資源的保護(hù)、遺傳改良以及養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有著重要應(yīng)用價值和理論意義。
　　1.太平洋鱈精液超低溫冷凍
　　采用分步降溫法冷凍保存太平洋鱈(Gadus macrocephalus)精液，并用掃

2、描電鏡和透射電鏡技術(shù)研究了精子的超微結(jié)構(gòu)損傷。分析了添加劑（蛋黃）及五種抗凍劑（PG（丙二醇）、DMSO(二甲基亞砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇)）不同濃度(8％、10％、12％、14％、16％、18％)對太平洋鱈精子冷凍保存效果的影響。實驗結(jié)果表明，蛋黃能夠顯著提高太平洋鱈冷凍保存效果(P＜0.05);在以HBSS為稀釋液，12％PG中添加10％蛋黃保存的凍融精子運動率最高（85.87％±1.6％），顯著高于其他

3、凍存組(P＜0.05)。添加蛋黃的12％濃度的DMSO組解凍后精子運動速率較高，平均直線速度、平均曲線速度、平均路徑速度分別達(dá)到了(120.39±20.78)μm/s、(120.39±20.78)μm/s、(155.64±12.02)μm/s，與其他各實驗組差異顯著(P＜0.05)。通過掃描電鏡和透射電鏡觀察新鮮和凍融后的鱈魚精子發(fā)現(xiàn)，鮮精中75.5％精子形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、24.5％精子形態(tài)結(jié)構(gòu)異常;運動率最高的凍精中67％精子形態(tài)結(jié)構(gòu)正常

4、、33％精子形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。超低溫保存對太平洋鱈精子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響，細(xì)胞膜破裂、線粒體腫脹變形，鞭毛脫落、斷裂。
　　2.條紋鋸鮨精液超低溫冷凍保存研究
　　為建立條紋鋸鮨（Centropristis striata）精液超低溫冷凍保存方法，實驗采用計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分析了六種抗凍保護(hù)劑(GLY[甘油]、DMSO[二甲基亞砜]、PG[丙二醇]、EG[乙二醇]、MeOH[甲醇]、DMA[二甲基乙酰胺]）在四種

5、不同濃度下(5、10、15、20％，v/v)對條紋鋸鮨精液冷凍保存的效果。結(jié)果顯示:以HBSS為稀釋液，采用程序降溫儀分步降溫冷凍保存條紋鋸能精液，37℃水浴解凍后的精子中，15％PG作為抗凍保護(hù)劑的精子運動率最高，達(dá)到93.1±0.9％，與鮮精差異不顯著(P＞0.05)，15％PG作為抗凍保護(hù)劑的精子水浴解凍后精子的運動速度最高，平均直線速度、平均曲線速度、平均路徑速度分別達(dá)到了(88.3±0.3)μm/s、(76.2±0.5)μm/

6、s、(86.7±0.7)μm/s，與鮮精差異不顯著(P＞0.05)。在不同種類及不同濃度抗凍保護(hù)劑保護(hù)下，15％PG作為抗凍保護(hù)劑的精子解凍后1min內(nèi)運動率變化與鮮精差異不顯著(P＞0.05)。研究表明，15％PG為條紋鋸鮨最佳抗凍保護(hù)劑，可用于條紋鋸鮨精液的超低溫冷凍保存。
　　3.太平洋牡蠣精液的超低溫保存研究
　　本研究篩選了六種抗凍保護(hù)劑(GLY[甘油]，DMSO[二甲基亞砜]，PG[丙二醇]，EG[乙二醇]，DM

7、A[二甲基乙酰胺]，MeOH[甲醇])及其五種不同濃度(6％，8％，10％，12％，14％，V/V)、三種稀釋液（無鈣HBSS，人工海水[ASW]，過濾海水[FSW]）、四種稀釋比例(1∶1，1∶2，1∶4，1∶6)、三種添加劑（蔗糖，葡萄糖，海藻糖）、三個分步降溫程序（程序A，程序B，程序C）對太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)精液冷凍保存的影響，成功建立了太平洋牡蠣精液超低溫保存方法:以10％ DMSO為抗凍保護(hù)劑，無

8、鈣HBSS為稀釋液，1∶4的稀釋比例，添加0.45mol/L的海藻糖，采用分布降溫法冷凍保存太平洋牡蠣的精液，37℃水浴解凍后精液運動率達(dá)到71.27％±3.24％，顯著高于其它實驗組(P＜0.05)，受精率和孵化率分別達(dá)到95.04％±1.99％、93.33％±1.33％，與鮮精(88.89％±15.16％，94.90％±0.95％)、程序冷凍前精液(95.96％±2.15％，92.67％±14.83％)差異不顯著(P＞0.05)，證

9、明該太平洋牡蠣精液超低溫保存方法可以應(yīng)用于生產(chǎn)實踐和科學(xué)研究中。
　　4.太平洋牡蠣精子超低溫冷凍后超微結(jié)構(gòu)損傷研究
　　采用程序降溫儀分步降溫冷凍保存太平洋牡蠣精液，并用掃描電鏡、透射電鏡研究了精子的超微結(jié)構(gòu)損傷。超低溫冷凍保存后太平洋牡蠣精子的運動率、受精率及孵化率與鮮精無顯著差異。鮮精中84.5％的精子形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，凍精中73％的精子形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的精子表現(xiàn)為頂體、質(zhì)膜、線粒體與鞭毛結(jié)構(gòu)完整、染色質(zhì)形狀規(guī)則

10、，項體、線粒體及中心粒結(jié)構(gòu)正常，鞭毛形態(tài)完整、微管結(jié)構(gòu)清晰;形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的精子表現(xiàn)為頂體脫落、解體，精子頭部質(zhì)膜膨脹、破裂、染色質(zhì)腫脹、破裂、解體，線粒體移位、脫落、膨脹，嵴退化或消失，鞭毛彎折、斷裂，微管解聚。結(jié)果顯示，以10％ DMSO為抗凍保護(hù)劑，HBSS溶液為稀釋液，1∶4的稀釋比例，添加海藻糖，采用分步降溫法冷凍保存，對太平洋牡蠣精子具有較好的抗凍保護(hù)作用，合適的凍存方法可以有效的保護(hù)太平洋牡蠣精子冷凍過程中結(jié)構(gòu)損傷。本研究將

11、有助于太平洋牡蠣種質(zhì)資源的收集保存及應(yīng)用。
　　5.太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的超低溫保存研究
　　本實驗研究了六種抗凍保護(hù)劑GLY(甘油)、DMSO(二甲基亞砜)、PG(丙二醇)、EG(乙二醇)、DMA(二甲基乙酰胺）和MET(甲醇)在三種不同濃度下(5％、10％、15％，v/v)對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用及冷凍保存的影響。太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲毒性實驗證明:抗凍保護(hù)劑的種類和濃度對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲產(chǎn)生的毒性強(qiáng)弱不同，在抗凍保護(hù)

12、劑濃度為5％時，GLY、DMSO、PG、EG對太平洋牡蠣的毒性作用顯著低于其他抗凍保護(hù)劑(P＜0.05);隨著抗凍保護(hù)劑濃度增加到10％，GLY、DMSO、EG、MET對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用顯著低于其他抗凍保護(hù)劑(P＜0.05);而抗凍保護(hù)劑濃度為15％時，GLY、DMSO對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用顯著低于其他抗凍保護(hù)劑(P＜0.05)，且隨著抗凍保護(hù)劑濃度的升高，其對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用也增大。太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的