HIF-1a基因多態(tài)性與COPD易感性的關(guān)系及其在COPD肺組織中表達(dá)與意義.pdf

1、第一章:缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因多態(tài)性與COPD易感性的關(guān)系
　　目的:
　　檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因(hypoxia-inducible factor-1a HIF-1a)第12外顯子上C1772T和G1790A單核苷酸多態(tài)性等位基因頻率及其組合基因型分布特征,以探討缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)易感性的關(guān)系。
　

2、　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.研究分兩組:慢性阻塞性肺疾病病例組120例,健康對(duì)照組112例。病例組人群均來自廣東省人民醫(yī)院就診的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者;健康對(duì)照組均為與病例組性別、年齡相匹配的來自于廣東省人民醫(yī)院體檢中心正常體檢的健康人群。收集時(shí)間為2010年5月至2011年6月。
　　2.抽取兩組人群(清晨、空腹)外周靜脈血2ml,采用全血基因組DNA提取試劑盒提取外周靜脈血基因組DNA。
　　3.利用限制性片段

3、長(zhǎng)度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)兩組人群缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因(HIF-1a)C1772T和G1790A的多態(tài)性分布。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)各基因頻率的代表性;兩組間基因型頻率、等位基因分布及性別構(gòu)成比采用χ2檢驗(yàn),兩組的年齡、吸煙指數(shù)、肺功能比較(FEV1/FVC、FEV1/預(yù)計(jì)值％)采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

4、。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.兩組人群間的性別、年齡、吸煙指數(shù)等無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),COPD病例組的FEV1/預(yù)計(jì)值(%)、FEV1/FVC(%)明顯低于健康對(duì)照組。
　　2.缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因COPD病例組、健康對(duì)照組及總?cè)藬?shù)組各基因型分別符合Hardy-Weinberg平衡定律,缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中具有群體代表性。
　　3.病例組缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因C1772T的CC、C

5、T、TT3種基因型分布頻率:87.5%、12.5%、0%,對(duì)照組:93.8%、6.2%、0%,兩組基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);病例組C、T等位基因分布頻率:93.8%、6.2%,對(duì)照組:96.9%、3.1%,兩組等位基因分布差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4.病例組缺氧誘導(dǎo)因子-1a基因G1790A的GG、GA、AA3種基因型分布頻率:96.7%、3.3%、0%,對(duì)照組:90.2%、9.8%、0%,兩

6、組基因型頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病例組G、A等位基因的分布頻率為:98.4%、1.6%,對(duì)照組:95.1%、4.9%,兩組等位基因分布差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　第二章:缺氧誘導(dǎo)因子-1a在COPD患者肺組織中的表達(dá)及意義
　　目的:
　　檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia-induciblefactor-1a HIF-1a)在慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructi

7、ve Pulmonary Disease,COPD)患者肺組織中的表達(dá)水平,探討HIF-1a與慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。
　　材料與方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組
　　研究分兩組:慢性阻塞性肺疾病需行肺葉組織切除組(以下簡(jiǎn)稱病例組,16例)及無慢性阻塞性肺疾病需行肺葉組織切除組(以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組,16例)。全部研究對(duì)象均選自廣東省人民醫(yī)院需行肺葉組織切除的肺組織標(biāo)本。本研究經(jīng)過廣東省人民醫(yī)院倫理委員

8、會(huì)批準(zhǔn),并通過受試對(duì)象的知情同意。收集時(shí)間為2010年5月至2011年6月。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法:
　　2.1、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的獲取與處理
　　實(shí)驗(yàn)所用的肺組織標(biāo)本取自盡量遠(yuǎn)離組織病灶(距病灶8cm以上)、肉眼觀察無明顯浸潤(rùn)的外周肺葉組織。手術(shù)取下肺組織標(biāo)本,立即置入液氮罐中速凍,然后將組織標(biāo)本移存于深低溫冰箱(-70℃)中長(zhǎng)期貯存?zhèn)溆?避免組織的反復(fù)凍融。
　　2.2、觀察指標(biāo):
　　1)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(

9、real time PCR,RT-PCR)方法檢測(cè)COPD病例組及對(duì)照組肺葉組織中HIF-1amRNA水平差異的表達(dá)情況。
　　2)通過酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測(cè)COPD病例組及對(duì)照組肺葉組織中HIF-1a蛋白水平差異的表達(dá)情況。
　　3)通過Westernblot方法進(jìn)一步檢測(cè)COPD病例組及對(duì)照組肺葉組織中HIF-1a蛋白水平差異的表達(dá)情況

10、。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,根據(jù)數(shù)據(jù)資料的不同類型,進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)處理。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(`x±s)表示,兩組間比較用t檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)得慢性阻塞性肺疾病病例組及對(duì)照組肺葉組織標(biāo)本中均表達(dá)HIF-1amRNA。依據(jù)各個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的CT值,按照公式Delta-deltaCt法計(jì)算病例組及對(duì)照組

11、肺葉組織標(biāo)本中HIF-1amRNA的表達(dá)程度。結(jié)果病例組與對(duì)照組肺葉組織標(biāo)本中HIF-1amRNA分別為:1.01±0.50、1.28±1.51;COPD病例組肺葉組織標(biāo)本中HIF-1amRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組,t檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法檢測(cè)可知,慢性阻塞性肺疾病病例組及對(duì)照組人群肺葉組織中均明顯表達(dá)HIF-1a。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算樣本濃度。結(jié)

12、果病例組與對(duì)照組肺葉組織中HIF-1a蛋白分別為:0.16±0.07、0.96±0.43;COPD病例組肺葉組織標(biāo)本中HIF-1a蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
　　3.Western blot進(jìn)一步分析HIF-1a蛋白水平的表達(dá),結(jié)果慢性阻塞性肺疾病病例組及對(duì)照組肺葉組織標(biāo)本中均表達(dá)HIF-1a蛋白。以HIF-1a和內(nèi)參β-actin灰度比值表示HIF-1a蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果病例組與對(duì)照組肺

13、葉組織標(biāo)本中HIF-1a蛋白分別為:0.53±0.15、0.71±0.22;COPD病例組肺葉組織標(biāo)本中HIF-1a蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);依據(jù)COPD疾病的嚴(yán)重程度將病例組人群分組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)輕中度COPD和重度COPD患者肺葉組織標(biāo)本中HIF-1a蛋白分別為:0.78±0.06、0.39±0.10;重度COPD患者肺葉組織標(biāo)本中HIF-1a蛋白表達(dá)水平明顯低于輕中度COPD患者,t檢驗(yàn)差異有