siRNA的化學(xué)合成及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用初探.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是近年來發(fā)展起來一項(xiàng)重要的反向遺傳學(xué)技術(shù)，由于它的快速、高效，可以實(shí)現(xiàn)基因沉默的高通量，而在生命科研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。在哺乳類(包括人類)RNAi研究中使用的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是一種19-23nt的帶有3'端的雙鏈RNA(doublestrainRNA，dsRNA)，化學(xué)合成是獲得siRNA最直接、最可靠的方法。本研究首先進(jìn)行siR

2、NA的化學(xué)合成的嘗試，進(jìn)而利用化學(xué)合成的siRNA沉默外源、內(nèi)源和病毒基因的實(shí)驗(yàn)研究。研究分為三個(gè)部分： 第一部分，siRNA的化學(xué)合成與有效性檢測(cè)，利用DNPA保護(hù)的核酸單體進(jìn)行siRNA的化學(xué)合成，通過與靶基因(報(bào)告基因EGFP)共轉(zhuǎn)染的方法定量檢測(cè)其基因沉默效果和細(xì)胞毒性作用。結(jié)果表明，合成的靶向EGFP的siRNA在100-300nM的轉(zhuǎn)染濃度下能夠有效沉默靶基因，同時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。 第二部分，靶向SMP

3、D1對(duì)卵母細(xì)胞自發(fā)性凋亡的保護(hù)作用，本研究中設(shè)計(jì)合成了六對(duì)siRNA，體外轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，Westernbot和熒光定量PCR方法檢測(cè)其基因沉默效果，篩選獲得3對(duì)有效的siRNA；通過顯微注射方法將較早期合成的3對(duì)siRNA導(dǎo)入小鼠卵母細(xì)胞，分別于48h和72h后利用彗星分析方法檢測(cè)DAN破壞程度來推測(cè)凋亡發(fā)生的情況。結(jié)果顯示，3對(duì)siRNA中的1對(duì)能夠顯著降低卵母細(xì)胞的DAN損傷程度。 第三部分，化學(xué)合成siRNA對(duì)SARS-