Tempol抗中波紫外線照射所致皮膚光老化的作用機制及影響因素的探討.pdf

1、本研究共分為兩部分，分別以HaCaT細胞和活體昆明無毛小鼠為UVB照射的體外和體內(nèi)實驗對象，利用Tempol為光保護劑，建立了Tempol抗UVB照射所致皮膚光老化的實驗?zāi)Ｐ?；通過分析實驗?zāi)Ｐ透鞣N觀察指標的變化，探討Tempol抗UVB照射所致光老化的作用機制，為防治光老化性疾病提供實驗依據(jù)。 第一部分 Tempol對中波紫外線照射所致HaCaT細胞光損傷防護作用機制的研究 目的: 1.建立UVB照射損傷

2、HaCaT細胞的光損傷模型，觀察Tempol對UVB照射所致HaCaT細胞光損傷防護作用的機制； 2.觀察Tempol對UVB照射后HaCaT細胞增殖效應(yīng)的影響及其影響因素的研究： 3.觀察Tempol對LIVB照射后HaCaT細胞細胞凋亡的影響及其影響因素的研究； 4.觀察Tempol對UVB照射后HaCaT細胞FoxO3a mRNA表達的影響及其影響因素的研究。 方法: 1.HaCaT細胞的光

3、損傷模型的建立1.1 HaCaT細胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM置37℃CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。 1.2紫外線光源UVB燈管，波長范圍290～320nm，峰值297 nm，40W，4只，4只燈管制成燈箱。 2.Tempol對光損傷防護作用實驗2.1 HaCaT細胞分組將HaCaT細胞分為七組，分別標記為A、B、C、D、E、F和G組。 A組：為正常對照組，不加入Tempol，不照射UVB； B

4、組：為UVB照射對照組，不加入Tempol，只照射UVB； C組：為含0.5mMTempol的實驗組； D組：為含1mMTempol的實驗組； E組：為含2mMTempol的實驗組； F組：為含4mMTempol的實驗組； G組：為含8mMTempol的實驗組。 2.2細胞培養(yǎng)和照射劑量HaCaT細胞在培養(yǎng)板上生長到每孔匯合至80％以上時，從細胞培養(yǎng)箱中取出，無菌條件下加入Tempol。正

5、常對照組和照射對照組只加角質(zhì)形成細胞專用培養(yǎng)基以使各孔的終體積相等。細胞放入37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1h后，除正常對照組外，其余六組均照射UVB，照射劑量為30mJ/cm2，光源與細胞的垂直照射距離為15cm。 2.3 HaCaT細胞增殖效應(yīng)的檢測HaCaT細胞經(jīng)UVB照射損傷并孵育18小時后，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入二甲基亞砜，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔吸光值。 2.4 Ha

6、CaT細胞凋亡率的檢測HaCaT 細胞經(jīng)LNB照射損傷并孵育18小時后，經(jīng)消化、離心，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106/ml，加入Annexin V-FTTC和PI溶液，流式細胞儀分析，測定HaCaT細胞的凋亡率。 2.5 HaCaT細胞FoxO3a mRNA表達的檢測HaCaT細胞經(jīng)UVB照射損傷并孵育18小時后，將所收集的細胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，通過RT-PCR技術(shù)檢測FoxO3amRNA的表達。 結(jié)論

7、 一定濃度范圍的Tempol(0.5mM，1mM，2mM，4mM，8mM)對UVB照射所致HaCaT細胞光損傷具有防護作用，其作用機制可能與提高HaCaT細胞增殖效應(yīng)，抑制HaCaT細胞凋亡以及抑制HaCaT細胞Fox03a過度表達有關(guān)；其保護作用隨Tempol濃度的升高而降低，0.5mMTempol的防護作用最強。 第二部分 Tempol抗中波紫外線照射所致無毛鼠皮膚光老化的作用機制及其影響因素的探討

8、 目的: 1.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時段照射UVB對皮膚外觀狀態(tài)變化的影響； 2.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時段照射UVB對皮膚膠原纖維和彈力纖維結(jié)構(gòu)變化的影響； 3.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時段照射UVB對皮膚超微結(jié)構(gòu)變化的影響； 4.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時段照射UVB對皮膚丙二醛和羥脯氨酸含量變化的影響； 5.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時段

9、照射UVB對皮膚突變型p53蛋白表達的影響。 6.探討時間因素對Tempol抗光老化作用的影響。 方法: 1.光老化動物實驗?zāi)Ｐ偷慕?.1實驗動物清潔級昆明種無毛小白鼠72只，鼠齡6～8周，雌雄各半，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，體重20～25g，按同窩、同性別、同條件下飼養(yǎng)。 1.2 紫外線光源UVB燈管，波長范圍290～320nm，峰值297 nm，40W，4只。將4只燈管制成燈箱，照射高度為5

10、0cm。 2.Tempol抗光老化實驗2.1動物分組將72只昆明種無毛小鼠隨機分為六組，每組12只，分別標記為A、B、C、D、E和F組。 A組：為正常對照組，外用三蒸水，不照射UVB； B組：為UVB照射對照組，外用三蒸水，照射UVB； C組：為外用0.36％Tempol 1h后照射UVB實驗組； D組：為外用0.36％Tempol 2h后照射UVB實驗組； E組：為外用0.36％Temp

11、ol 4h后照射UVB實驗組； F組：為外用0.36％Tempol 8h后照射UVB實驗組。 2.2 照射劑量除正常對照組外，其余五組均隔日照射UVB一次，照射劑量為0.111J/(cm2·次)，共14周，總劑量5.45J/cm2。 2.3 無毛小鼠皮膚外觀狀態(tài)變化的檢測選擇昆明無毛小鼠背部皮膚2x3cm2范圍，外用三蒸水或0.36％Tempol后，按上述分組情況進行紫外線照射實驗，隔周記錄皮膚外觀狀態(tài)并進行評分

12、，共14周。 2.4 無毛小鼠皮膚膠原纖維和彈力纖維變化的檢測末次紫外線照射實驗結(jié)束后，頸椎脫臼法將各組動物處死，用銳利刀片取其背部照射區(qū)面積0.5cm2大小的皮膚組織，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、HE及間苯二酚品紅法染色，在顯微鏡下觀察真皮內(nèi)膠原纖維和彈力纖維含量的變化及病理形態(tài)學(xué)改變。 2.5 無毛小鼠皮膚成纖維細胞和膠原纖維超微結(jié)構(gòu)變化的檢測在常規(guī)組織病理取材的同時，取背部0.1cm3的皮膚組織2～3塊，經(jīng)固定、脫水

13、、包埋、定位，制成50nm超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，HITACHI透射電子顯微鏡觀察成纖維細胞和膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的變化。 2.6 無毛小鼠皮膚丙二醛(MDA)和羥脯氨酸(HYP)含量變化的檢測2.6.1 組織勻漿的制備和MDA含量的檢測在常規(guī)組織病理取材的同時，取各組無毛小鼠背部照射區(qū)皮膚，去除皮下脂肪稱重，制成10％組織勻漿；取0.1ml 10％組織勻漿，先后加入1、2、3號MDA測定試劑并混勻，95℃水浴中40mi

14、n，3500-4000r/min，離心10min，取上清液，分光光度計532am比色，計算MDA含量。 2.6.2 HYP含量的檢測在常規(guī)組織病理取材的同時，取各組無毛小鼠背部照射區(qū)皮膚，精確稱取皮膚(濕重)30-100mg放入試管，加入1ml水解液，加蓋后95℃或沸水浴水解20min，調(diào)PH值至6.0-6.8左右，加蒸餾水至10ml，取3ml稀釋的水解液加活性炭混勻， 3500r/min，離心10min，取上清液1ml先后加入

15、試劑1、2、3并混勻，60℃水浴中1.5min，冷卻后3500r/min，離心10min，取上清，分光光度計550nm比色，計算HYP含量。 2.7 無毛小鼠皮膚突變型p53蛋白表達的檢測在常規(guī)組織病理取材的同時，取各組無毛小鼠背部照射區(qū)皮膚，進行突變型p53蛋白表達的免疫組化檢測，檢測結(jié)果經(jīng)美國Leiea DMI4000B圖像處理系統(tǒng)進行圖像的積分吸光度(A)分析。 結(jié)論: 外用0.36％的Tempol對UVB