職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎患者血清多肽指紋圖譜的檢測及其臨床意義.pdf

1、研究背景及目的：
　　 近年來國內(nèi)外因職業(yè)性接觸三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)而引起中毒的事件屢見報道，其中以職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎(Occupational Medicamentosa-Like Dermatitis induced by Trichloroethylene，OMLDT)居多。自1988年以來廣東省先后在TCE接觸工人中發(fā)現(xiàn)以嚴重皮損、發(fā)熱、肝功能損害和淺表淋巴結(jié)腫大為表現(xiàn)的病例，至2

2、009年已有394例，并且每年約有20例新發(fā)病例出現(xiàn)，被動接觸人群也是逐年增加。該病起病急、易誤診、后果嚴重，現(xiàn)有預(yù)防措施效果不理想，已成為我國職業(yè)病危害的新問題。但目前其發(fā)病機制仍不明確，而且缺乏有效的疾病診斷和監(jiān)測的生物學(xué)手段。因此，闡明其發(fā)病機制、尋找早期診斷生物標志以及治療靶標具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。
　　 目前OMLDT成為研究者關(guān)注的熱點問題。研究內(nèi)容主要集中在臨床病例分析、回顧性職業(yè)流行病學(xué)調(diào)查、疾病易感基因

3、多態(tài)性、免疫損傷機制等方面，但這些研究結(jié)果尚處于基礎(chǔ)研究階段，尚未在人群中驗證，因此還無法作為有效的防治手段應(yīng)用于實際工作。越來越多的證據(jù)表明血清中的蛋白質(zhì)/多肽常常是疾病的診斷標志，是獲得生物標志的豐富資源之一。研究疾病與健康狀態(tài)下血清蛋白質(zhì)的差異，將有助于尋找關(guān)鍵蛋白和標志蛋白，對于闡明疾病發(fā)生機制、尋找早期生物監(jiān)測指標以及藥物治療靶標具有重要意義。
　　 本研究應(yīng)用功能磁珠、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix

4、AssistedLaser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)和ClinProTools生物信息學(xué)方法分離和篩選OMLDT患者發(fā)病各時期血清樣本，建立OMLDT診斷模型，并分析其中蛋白質(zhì)/多肽變化情況以了解整個病程中不同時期血清蛋白/多肽的動態(tài)變化規(guī)律，有望找到差異蛋白/多肽，為臨床早期診斷和篩選高危人群提供參考。
　　 方法：

5、
　　 1、研究對象
　　 2009年12月至2011年10月共收集21例OMLDT患者、64例職業(yè)性TCE接觸工人、56例正常人用于臨床調(diào)查研究；篩選18例OMLDT患者、29例職業(yè)性TCE接觸工人、29例正常人用于OMLDT診斷模型的建立和驗證；7例OMLDT典型患者用于動態(tài)變化研究。
　　 2、臨床調(diào)查研究
　　 對21例OMLDT患者臨床資料和臨床檢測指標進行研究，分析其發(fā)病特點和規(guī)律、暴露和防治

6、情況，并與64例職業(yè)性TCE接觸工人以及56例正常人進行比較。
　　 3、OMLDT診斷模型的建立和驗證
　　 首先將2大影響血清蛋白/多肽指紋圖譜的因素-樣品處理和質(zhì)譜檢測條件進行了優(yōu)化，主要包括整個實驗的重復(fù)性評估、蛋白定量對模型的影響。然后按照一定標準選擇OMLDT患者、TCE接觸者和正常人群血清樣品，采用MB-WCX聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測血清多肽指紋圖譜，應(yīng)用ClinProTools軟件建立OMLD

7、T疾病診斷模型，初步篩選OMLDT差異蛋白/多肽。然后用另一部分實驗對象驗證模型，評價模型的敏感性和特異性。進一步將急性期/接觸者模型和急性期/正常人模型中的差異峰進行統(tǒng)計，以找到屬于OMLDT的特征峰。
　　 4、OMLDT典型病例動態(tài)變化研究
　　 根據(jù)OMLDT的特征峰，分析7例患者各個時期血清多肽指紋圖譜，了解整個病程中不同病期血清蛋白組學(xué)的動態(tài)變化規(guī)律，同時進一步篩選并初步驗證OMLDT血清蛋白/多肽標志。

8、r>　　 結(jié)果：
　　 1、臨床調(diào)查研究結(jié)果
　　 OMLDT發(fā)病主要以年輕人為主，起病時不易引起醫(yī)生和患者的重視而延誤治療。發(fā)病時主要表現(xiàn)為畏寒發(fā)熱、納差厭油膩、皮疹和肝損害，伴有眼損害。B超發(fā)現(xiàn)肝膽脾受損嚴重。絕大部分患者WBC、EO和CRP明顯升高，RBC和HGB水平顯著降低；大部分都是急性重度中毒性肝病，主要表現(xiàn)為蛋白水平降低，而膽紅素和酶學(xué)指標水平明顯升高；腎功能基本穩(wěn)定。甲基強的松龍激素治療有效，有7例出現(xiàn)

9、了病情反跳，1例轉(zhuǎn)院治療，其余均治愈出院。職業(yè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)OMLDT患者存在于不同車間不同環(huán)境中，發(fā)病主要原因是防護措施過于簡單、車間通風(fēng)不良、工作人數(shù)較多以及工作時間長。
　　 2、OMLDT診斷模型的建立和驗證結(jié)果
　　 2.1、血清多肽指紋圖譜實驗條件優(yōu)化結(jié)果
　　 不管是日內(nèi)重復(fù)性還是日間重復(fù)性，各次實驗的血清多肽指紋圖譜基本一致，絕大部分峰的CV值<40％，表明基于MB-WCX的MALDI-TOF-MS技術(shù)

10、能夠得到重復(fù)性高和穩(wěn)定性好的血清多肽指紋圖譜；同樣的樣本經(jīng)過定量得到的血清多肽譜峰數(shù)要明顯多于沒有經(jīng)過定量的，而且模型交互驗證和識別能力也要基本高于未定量樣本，但是敏感性和特異性卻低于未定量樣本。我們認為，定量樣本用于建模和驗證更加嚴謹、可靠。
　　 2.2、急性期和正常人模型
　　 我們對OMLDT急性期患者和正常人血清多肽指紋圖譜進行統(tǒng)計共得到158個峰，72個有統(tǒng)計學(xué)意義的峰，其中有52個差異峰。52個差異峰中，有

11、28個相對于正常人是低表達的，有24個是高表達的。我們從2D分布圖上明顯看到m/z為2106和2135Da的2個差異峰能夠很好地區(qū)分急性期患者和正常人。ROC曲線分析也表明m/z為2106和2135Da的2個差異峰AUC值最大，幾乎接近1，能夠很好地區(qū)分急性期患者和正常人。我們應(yīng)用SNN算法進行識別分析后篩選出由3個m/z分別為2106.3、2134.5和3263.67Da構(gòu)建的診斷模型，交叉驗證和識別能力分別是94.44％和100％。

12、進一步用另一部分實驗對象對模型進行驗證，敏感性和特異性分別是100％和66.7％。
　　 2.3、急性期和接觸者模型
　　 我們對OMLDT急性期患者和TCE接觸者血清多肽指紋圖譜進行檢測共得到157個峰，72個有統(tǒng)計學(xué)意義的峰，其中有35個差異峰。35個差異峰中，有13個相對于TCE接觸者是低表達的，有22個是高表達的。進一步通過2D峰分布圖發(fā)現(xiàn)m/z為1450和5065Da的2個差異峰可以對兩組樣本進行有效區(qū)分，RO

13、C曲線分析也表明這2個差異峰能夠較好地區(qū)分急性期患者和接觸者。我們應(yīng)用SNN算法建立了由m/z為1450.33、1866.16、3262.39、4109.55、5064.85、5248.05、5956.57和6667.04Da共8個多肽峰組成的疾病診斷模型，交叉驗證和識別能力分別是97.22％和100％。進一步用另一部分實驗對象對模型進行驗證，敏感性和特異性分別是81.3％和100％，說明建立的OMLDT急性期患者和TCE接觸者診斷模型

14、顯示了良好的區(qū)分能力。
　　 2.4、OMLDT特征峰分析結(jié)果
　　 我們將急性期/正常人模型和急性期胺觸者模型中的差異峰進行統(tǒng)計，結(jié)果共得到21個相同的差異峰，并且其表達水平變化也是一致的。其中有9個相對于接觸對照組和正常對照組是低表達的，有12個是高表達的。
　　 3、OMLDT典型病例動態(tài)變化研究結(jié)果
　　 在OMLDT21個特征峰中，我們發(fā)現(xiàn)4例病情反跳者在皮疹剝脫期、皮疹反跳期和恢復(fù)正常期3個時

15、期內(nèi)有4個蛋白/多肽峰的動態(tài)變化是基本一致的，m/z分別是4109、4267、5065和9287Da；3例非病情反跳者在急性皮疹期、皮疹剝脫期和恢復(fù)正常期3個時期內(nèi)有2個蛋白/多肽峰的動態(tài)變化是完全一致的，m/z分別是4109和9173Da。而m/z為4109Da的特征峰在反跳組和非反跳組中均有出現(xiàn)，并且其表達水平隨病程的變化呈現(xiàn)升高的趨勢，提示其也許是OMLDT特有的血清學(xué)生物標志。
　　 結(jié)論：
　　 l、OMLDT

16、主要以畏寒發(fā)熱、納差厭油膩、皮疹和肝損害為主要特征；激素治療有效；由接觸TCE引起，發(fā)病也許跟個體遺傳易感因素有關(guān)，為一種職業(yè)性免疫損傷疾??；職業(yè)防護措施有待進一步加強。
　　 2、本研究應(yīng)用MB-WCX聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合ClinProToolsTM軟件首次對OMLDT建立診斷模型并進行驗證，得到較高的敏感性和特異性，篩選到了特異性差異蛋白/多肽，為臨床早期診斷提供了參考。
　　 3、特征峰峰面積概率分