中藥抗肺癌反應(yīng)性基因研究及中醫(yī)綜合治療臨床研究方法探討.pdf

1、肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，2002年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，估計(jì)有1352132新發(fā)病例和1178918人死亡(WHO2002)。發(fā)病率發(fā)達(dá)國家多于發(fā)展中國家，在腫瘤患者中，男性肺癌占30.9％，女性占12.6％。近年來，肺癌發(fā)病率在我國增長(zhǎng)很快，2002年我國肺癌發(fā)病在男性為269650人，女性為126718人(WHO2002)。Meta分析顯示化療對(duì)非小細(xì)胞肺癌治療不敏感。沒有足夠的證據(jù)表明，任何放療方案對(duì)非小細(xì)胞肺癌有較

2、大的緩解，大劑量帶來更多的毒性作用，體能狀況較好的病人給予大劑量可適當(dāng)增加生存期(1年6％，2年3％)。術(shù)后放療對(duì)早期完全切除的非小細(xì)胞肺癌是有害的，不能做為此類患者的常規(guī)治療，對(duì)N2腫瘤的治療作用還不清楚。提高肺癌療效的措施是多學(xué)科綜合治療，其中中醫(yī)藥治療占有重要地位。　　中藥抗腫瘤反應(yīng)性基因研究部分選擇基礎(chǔ)研究比較充分，臨床應(yīng)用多年的中藥康萊特注射液(薏苡仁脂的靜脈油乳劑)，進(jìn)行其抗LA795肺腺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移的中藥反應(yīng)性基因研究。

3、本研究是國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30070957)：薏苡仁脂抗腫瘤轉(zhuǎn)移反應(yīng)性基因研究的第二部分，并根據(jù)前期中藥抗癌癥惡病質(zhì)基因芯片研究(國家中醫(yī)藥管理局課題)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出三張芯片差異表達(dá)基因27條，表達(dá)增高基因25條，表達(dá)降低的基因2條。兩張芯片的差異表達(dá)基因52條。接種部位瘤組織差異表達(dá)基因14條，共93條差異表達(dá)基因。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)約21條差異表達(dá)基因與腫瘤相關(guān)，其中多與腫瘤免疫相關(guān)，進(jìn)一步檢索腫瘤免疫相關(guān)基因37條，加入看家基因2

4、0條，定制含150條50-mer基因的康萊特中藥反應(yīng)性相關(guān)基因寡核苷酸圍欄芯片，評(píng)價(jià)康萊特注射液對(duì)LA795肺腺癌小鼠基因表達(dá)的影響，通過實(shí)驗(yàn)來研究康萊特抑制腫瘤的分子機(jī)制及尋找潛在的新的一些治療靶點(diǎn)。　　首先進(jìn)行康萊特的抑瘤實(shí)驗(yàn)，觀察康萊特組體重增加最多，環(huán)磷酰胺組體重增加較少，有比較顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？等R特組和荷瘤對(duì)照組體重增加差異不顯著，但由于荷瘤對(duì)照組小鼠瘤體較大，小鼠凈重康萊特組最大，環(huán)磷酰胺組其次，荷瘤對(duì)照組

5、最小。實(shí)驗(yàn)首先重復(fù)LA795肺腺癌轉(zhuǎn)移模型，康萊特抑瘤率為66.92％，與荷瘤對(duì)照組比較，具有非常顯著性差異(P＜0.01)，與環(huán)磷酰胺比較無明顯差異，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。康萊特組肺轉(zhuǎn)移率為93.3％，但轉(zhuǎn)移灶以Ⅱ組居多；與對(duì)照組比較差異非常顯著(P＜0.01)。康萊特組與環(huán)磷酰胺組比較，無明顯差異(P＞0.05)?！　∵x擇北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司的寡核苷酸(Oligo)芯片技術(shù)，點(diǎn)制成每基因50個(gè)核苷的圍欄芯片，即挑選的150個(gè)基

6、因在每張玻片上共點(diǎn)制成4個(gè)亞陣，每個(gè)亞陣包括450個(gè)基因(即150個(gè)基因重復(fù)點(diǎn)三次)，每個(gè)亞陣可以獨(dú)立為一對(duì)樣本(對(duì)照樣本和實(shí)驗(yàn)樣本)進(jìn)行雜交反應(yīng)。正常對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組肺組織分別混合，康萊特隨機(jī)取三只小鼠肺組織，分別提取mRNA。以定制的Oligo芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)、熒光標(biāo)記，并進(jìn)行熒光交換，即在芯片上每個(gè)基因重復(fù)3次，熒光交換處理以后每個(gè)基因會(huì)有6次重復(fù)結(jié)果，用t-檢驗(yàn)的方法挑選差異基因。　　在95％顯著性水準(zhǔn)上為顯著差異，整理出康

7、萊特三張芯片相同差異表達(dá)基因，差異大于1.5倍以上，且趨勢(shì)一致基因10條，其中表達(dá)上調(diào)8條，分別是AA051577、AW549803、M63244、M75721、NM007606、NM008302、NM_025567、X66032；下調(diào)2條，分別是AF184981、U13921。與正常對(duì)照組比較，趨勢(shì)一致的基因有5條，分別是AF184981、AW549803、NM007606、NM008302、NM025567。其中：腫瘤抑制基因cyc

8、linB2在康萊特用藥后三組實(shí)驗(yàn)中均表達(dá)上調(diào)，考慮cyclinB2在G2/M期大量表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期中G2/M時(shí)相細(xì)胞，減少有絲分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。鼠的CyclinB2促進(jìn)劑受細(xì)胞周期依賴素(CDC)的調(diào)節(jié)，cdc2促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移明確地與cyclinB2相關(guān)?？等R特促進(jìn)cyclinB2表達(dá)，有可能抑制cdc2表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。與荷瘤對(duì)照組相比，腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制的康萊特治療組KLT1、KLT2、KLT3的alpha-1P

9、I-1分別上調(diào)為1.7786，2.1292和1.1629，而在正常對(duì)照組沒有差異表達(dá)，并經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR證實(shí)。說明康萊特具有促進(jìn)alpha-1蛋白抑酶基因表達(dá)的作用，可能進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。IL-1在三組樣品中均表達(dá)下調(diào)為0.7314，0.7509，0.7179，而正常對(duì)照組表達(dá)下調(diào)為0.4451，說明康萊特具有一定的恢復(fù)腫瘤惡病質(zhì)升高的IL-1水平的作用，但未能恢復(fù)至正常水平。同時(shí)，康萊特抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能是通過上調(diào)alpha-

10、1水平，作為體液抑制劑來抵抗IL-1的產(chǎn)生。康萊特具有恢復(fù)細(xì)胞色素C、等至正常水平的作用，可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放來抑制T細(xì)胞調(diào)亡，進(jìn)而提高抗腫瘤免疫、。康萊特具有恢復(fù)碳酸脫水酶3至正常水平，下調(diào)FMO2的表達(dá)，可能通過這一機(jī)制改善機(jī)體的新陳代謝，抑制腫瘤，緩解腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)?！　∨R床部分考慮到辨證施治是中醫(yī)的特色，即需要根據(jù)患者的具體證候，而不是根據(jù)腫瘤的病理類型決定采用何種治療方案。在確定了治療方案后，中醫(yī)還要對(duì)方劑進(jìn)行加減，

11、不同患者的治療差異很大。因此研究過程中處理因素難以統(tǒng)一，從而造成試驗(yàn)可重復(fù)性差，隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)(RCT)難以進(jìn)行。醫(yī)生需根據(jù)患者的不同證候開具不同配伍中藥，研究中也很難遵循盲法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則?！　「鶕?jù)中醫(yī)藥治療腫瘤的特點(diǎn)，特別是導(dǎo)師提出的中醫(yī)綜合治療腫瘤的理論，針對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌，利用計(jì)算機(jī)SQLsever數(shù)據(jù)庫技術(shù)，設(shè)計(jì)晚期非小細(xì)胞肺癌臨床病例分析數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，從實(shí)在病例中抽取實(shí)際治療的東西，反應(yīng)臨床實(shí)際治療的情況，總結(jié)中醫(yī)綜合治療腫

12、瘤的特點(diǎn)，特別是中醫(yī)辨證論證的特色。避免一方一藥人為地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)存在的種種弊端，希望借此研究，拋磚引玉，探索一條新的臨床研究方法。　　其中辨證論證有效方藥部分，為了體現(xiàn)不同醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)的程度不同，采用加權(quán)的方法，主任醫(yī)師×3，副主任醫(yī)師×2，主治醫(yī)師及醫(yī)師×1。隨訪102例患者中，存活8例，中位生存期11月(6月-38月)，1年生存率為35.3％。其中研究生期間臨床系統(tǒng)觀察的32例患者中位生存期為11.5月(6.2月-24.

13、5月)，1年生存率為37.5％。中醫(yī)綜合治療后卡氏評(píng)分較前增加，體重穩(wěn)定，可有效改善患者神疲乏力、少氣懶言、氣短、咳嗽、痰多、疼痛、納谷少馨、痰中帶血、大便干結(jié)、口干咽燥、便溏、腹脹、腰膝酸軟等癥候。其中神疲乏力、少氣懶言、咳嗽、痰多、疼痛、納谷少馨、痰中帶血、大便干結(jié)、便溏等癥候的改善與治療前比較，具有非常顯著的意義(P＜0.01)；氣短、口干咽燥、腹脹、腰膝酸軟等癥候的改善與治療前比較，具有顯著的差異(P＜0.05)?？梢杂行Ц纳剖?/p>

14、欲、精神、疲乏、疼痛、自身對(duì)癌癥的認(rèn)識(shí)、對(duì)治療的態(tài)度等。精神、疲乏、疼痛具有非常顯著性差異(P＜0.01)。食欲、自身對(duì)癌癥的認(rèn)識(shí)、對(duì)治療的態(tài)度具有顯著性差異(P＜0.05)。提高CD4、CD4/CD8、NK細(xì)胞活性。CD4與治療前相比，具有顯著性差異(P＜0.05)，CD4/CD8、NK細(xì)胞活性與治療前相比，具有非常顯著性差異(P＜0.01)?！　挠?jì)算機(jī)分析結(jié)果可以看出，辨證分型中肺氣虛約占32.4％；脾氣虛約占31.4％；肺陰虛

15、約占28.2％；腎陰虛14.7％；痰濕40.2％；瘀血約占20.6％。以方測(cè)證進(jìn)行辨證治則統(tǒng)計(jì)，扶正為主約占60.8％，祛邪為主約占39.2％，補(bǔ)氣約占34.3％，潤(rùn)肺約占33.3％，健脾約占37.3％，滋腎約占14.7％，祛痰約占34.3％，化瘀約占17.6％，止咳約占17.6％，清熱約占29.4％。分析晚期非小細(xì)胞肺癌正虛邪實(shí)是其基本病機(jī)，且以正虛為主，正虛之中又多表現(xiàn)為肺氣虛、肺陰虛、脾氣虛及腎陰虛。邪實(shí)則為痰濕、瘀血，為本虛標(biāo)實(shí)