江蘇某奶牛場(chǎng)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的分子流行病學(xué)與遺傳相關(guān)性分析研究.pdf

1、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）又被稱為產(chǎn)Vero細(xì)胞毒素大腸桿菌，是一類能夠產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌，是近幾十年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一群最重要的能夠引起人類潛在致命性疾病的食源性致病菌，而EHEC O157∶H7則是其中的典型代表。高危人群老人和兒童感染產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌后表現(xiàn)為腹瀉、出血性腸炎等癥狀，易繼發(fā)感染溶血性尿毒綜合征。本研究在2014年對(duì)江蘇某奶牛場(chǎng)進(jìn)行定期采樣，

2、分離鑒定產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌并用Vero細(xì)胞和BALB/c小鼠做致病性研究，以脈沖場(chǎng)凝膠電泳作聚類分析繪制出系統(tǒng)進(jìn)化樹做遺傳相關(guān)性分析，對(duì)于了解奶牛場(chǎng)STEC的流行情況等具有重要的意義。
　　1江蘇某奶牛場(chǎng)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的分離鑒定
　　對(duì)江蘇某奶牛場(chǎng)于2014年3、6、9、12月份進(jìn)行定期采樣，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法分離產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌，以初步了解STEC在該奶牛場(chǎng)的流行情況。用本實(shí)驗(yàn)室建立的多重PCR對(duì)病原菌的stx

3、1、stx2兩個(gè)基因進(jìn)行初步檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性的樣品，通過(guò)挑取CT-SMAC上的菌落繼續(xù)分離純化再應(yīng)用多重PCR檢測(cè)stx1、stx2、eaeA、ehxA這四個(gè)毒力基因，經(jīng)四重PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣品則繼續(xù)分離純化。本次調(diào)查中江蘇某奶牛場(chǎng)STEC總的陽(yáng)性率為12.56％，總分離率為2.07％，犢牛的陽(yáng)性率為17.50％，犢牛的分離率為4.44％。
　　本次調(diào)查中共分離到12種不同的O血清型STEC，包括O13、O16、O25、O55、O6

4、8、O161等血清型，也分離到了O55等對(duì)人類具有嚴(yán)重危害的血清型，同時(shí)O55也是該牛場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)血清型。
　　本研究選用4株STEC制備細(xì)菌毒素接種于Vero細(xì)胞，24h后觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓、皺縮，之后逐漸死亡。選擇3周齡的雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將?jīng)萘啶酮酸誘導(dǎo)的STEC采用灌胃的方式接種于小鼠，給實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃的同時(shí)采用腹腔注射的方式接種絲裂霉素C，在攻毒后的2-7d內(nèi)，攻毒組小鼠出現(xiàn)不同程度的死亡，其中STEC109攻毒

5、組死亡率最高。從攻毒小鼠的病理切片可以觀察到小鼠的結(jié)腸黏膜的上皮細(xì)胞發(fā)生壞死脫落，肝臟、脾臟均出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　2產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌分離株的遺傳相關(guān)性分析
　　對(duì)江蘇某奶牛場(chǎng)分離到的17株產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌基因組用XbaⅠ酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，通過(guò)UPGMA進(jìn)行聚類分析繪制出系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分析其遺傳相關(guān)性。這17株STEC通過(guò)XbaⅠ酶切得到了17種不同的酶切圖譜，相似指數(shù)在41.8％-90.3％之間，STEC1