重金屬清除劑金屬硫蛋白對(duì)低溫誘導(dǎo)心肌收縮功能不足保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、眾所周知，外界環(huán)境溫度降低是導(dǎo)致心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率顯著增加的重要危險(xiǎn)因素之一。據(jù)相關(guān)研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，當(dāng)外界環(huán)境溫度每降低10℃，心血管系統(tǒng)疾病事件的發(fā)生率大約會(huì)增加15-20％左右。在本身就存在有心血管系統(tǒng)或者呼吸系統(tǒng)疾病的高危人群中，暴露于寒冷的環(huán)境，會(huì)加劇心血管事件的發(fā)生。雖然很多研究表明低溫暴露對(duì)心血管系統(tǒng)有重要的損傷性影響，但至今其機(jī)制尚未完全明確。與此同時(shí)，眾多的研究結(jié)果證實(shí)，一種富含半胱氨酸的重金屬清除劑，金屬

2、硫蛋白(Metallothionein，MT)具有良好的心臟保護(hù)功能，特別是在衰老、肥胖、胰島素抵抗以及糖尿病性心臟病中，其心臟保護(hù)作用效果明顯。因此，本課題研究旨在探討金屬硫蛋白在小鼠心臟過(guò)表達(dá)后，對(duì)低溫暴露誘導(dǎo)所致心肌收縮功能不足的相關(guān)保護(hù)性作用機(jī)制，重點(diǎn)探討金屬硫蛋白對(duì)心肌細(xì)胞自噬作用和氧化應(yīng)激作用的影響。經(jīng)過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)，低溫暴露(4℃)3周后，小鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激作用、蛋白質(zhì)氧化損傷明顯增強(qiáng)，左心室收縮末期和舒張末期內(nèi)徑增大，

3、心臟短軸收縮分?jǐn)?shù)和心肌收縮能力明顯被抑制，而金屬硫蛋白可以顯著緩解上述損傷性趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)低溫誘導(dǎo)后，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ，Beclin-1和Atg7的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，但p62蛋白的表達(dá)水平改變不明顯。熒光免疫組織化學(xué)以及免疫共沉淀的結(jié)果均進(jìn)一步證明了低溫可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬作用的顯著增強(qiáng)，與此同時(shí)，自噬相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路蛋白Akt，mTOR以及eNOS的磷酸化水平也明顯下降，而心臟過(guò)表達(dá)金屬硫蛋白可以明顯抑制心肌細(xì)胞

4、自噬作用的增強(qiáng)。小鼠體內(nèi)給藥自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)，體外給藥抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和自噬流抑制劑Bafilomycin A1均可改善低溫誘導(dǎo)所致的心功能不足。綜上所述，本研究結(jié)果表明金屬硫蛋白可以通過(guò)抑制小鼠心肌自噬和氧化應(yīng)激作用來(lái)發(fā)揮其對(duì)低溫誘導(dǎo)所致心肌收縮功能不足的保護(hù)性影響。
　　第一部分重金屬清除劑金屬硫蛋白對(duì)低溫誘導(dǎo)所致的心肌收縮功能不足具有保護(hù)性作用
　　目的:探討重金屬清除劑金屬硫蛋白

5、對(duì)低溫誘導(dǎo)所致的小鼠心肌收縮功能不足是否具有保護(hù)性作用。
　　方法:將5-6個(gè)月齡的成年雄性FVB(Friendly virus B)野生型小鼠，5-6個(gè)月齡的成年雄性金屬硫蛋白MT心臟過(guò)表達(dá)(Metallothienion Overexpression)轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為FVB常溫組、FVB低溫組、MT常溫組和MT低溫組四組，其中FVB常溫組和MT常溫組放于正常室溫下飼養(yǎng)，F(xiàn)VB低溫組和MT低溫組放于4℃低溫室內(nèi)飼養(yǎng)，四組均飼養(yǎng)

6、3周后分別進(jìn)行M型超聲波心動(dòng)圖診斷和Langendorff小鼠心臟體外灌流實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:FVB小鼠、MT小鼠分別于常溫、低溫飼養(yǎng)3周后，經(jīng)2D M-mode超聲波心動(dòng)圖診斷發(fā)現(xiàn)FVB低溫組的左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)較FVB常溫組明顯增大(P＜0.05)，心臟短軸縮短分?jǐn)?shù)FS(Fractional Shortening)較FVB常溫組顯著降低(P＜0.05)，金屬硫蛋白MT心臟過(guò)表達(dá)明顯

7、減輕了低溫對(duì)左心室收縮功能的損傷(P＜0.05)。但低溫對(duì)小鼠體重(Body Weight)，心率(Heart Rate)，左心室壁厚度(LV wall Thickness)，左心室質(zhì)量(LV Mass)，以及心輸出量(Cardiac Output)均沒(méi)有明顯改變(P＞0.05)。小鼠心臟體外灌流實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FVB低溫組的左心室壓力變化(LVDP，Leftventricular developed pressure)，壓力發(fā)展上升速率(+d

8、P/dt)，壓力發(fā)展下降速率(-dP/dt)與FVB常溫組相比較有明顯降低趨勢(shì)(P＜0.05)，金屬硫蛋白MT心臟過(guò)表達(dá)可緩解這一損傷性趨勢(shì)。FVB常溫組與MT常溫組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:功能性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明低溫可以誘導(dǎo)小鼠心肌收縮功能不足，心臟過(guò)表達(dá)金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠可以抵抗低溫誘導(dǎo)所致的心肌收縮功能不足，說(shuō)明重金屬清除劑金屬硫蛋白對(duì)低溫誘導(dǎo)所致的心肌收縮功能不足具有保護(hù)性作用。
　　第二部分重金屬清除劑金屬

9、硫蛋白通過(guò)抑制心肌細(xì)胞自噬作用減輕低溫誘導(dǎo)所致的心肌收縮功能不足
　　目的:探討重金屬清除劑金屬硫蛋白是否可以通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞自噬作用改善低溫誘導(dǎo)所致的小鼠心肌收縮功能不足。
　　方法:用蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)在常溫和低溫下飼養(yǎng)3周后的FVB小鼠和MT轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌組織中與自噬相關(guān)的蛋白表達(dá)水平，包括微管相關(guān)蛋白-Ⅰ(LC3B-Ⅰ)，微管相關(guān)蛋白-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)，自噬相關(guān)基因7(Atg7)

10、，非同位類激酶1(ULK-1)，磷酸化非同位類激酶[pULK-1(Ser777)]，Beclin-1，p62，以及自噬相關(guān)信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平，包括蛋白激酶B(Akt)，磷酸化蛋白激酶B(pAkt)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(pmTOR)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(peNOS)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)，核糖體蛋白S6

11、激酶(p70S6K)，磷酸化核糖體蛋白S6激酶(pp70S6K)，并且用熒光免疫組化的方法檢測(cè)低溫下微管相關(guān)蛋白(LC3B)的表達(dá)水平，以及低溫下體內(nèi)給藥自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methlyadenine，3-MA，10 mg/kg/wk，i.p.，3周）后的微管相關(guān)蛋白(LC3B)的表達(dá)水平。應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測(cè)Bcl2和自噬相關(guān)蛋白Beclin1的相互作用關(guān)系。將FVB常溫組和FVB低溫組飼養(yǎng)3周后的小鼠，用SoftEdge

12、 MyoCam system(IonOptix，Milton，MA，USA)分別檢測(cè)體內(nèi)給藥自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methlyadenine，3-MA，10 mg/kg/wk，i.p.，3周）和體外給藥溶酶體抑制劑Bafilomycin A1（100nM，4小時(shí)）后單個(gè)心肌細(xì)胞的收縮功能。
　　結(jié)果:低溫飼養(yǎng)3周后，F(xiàn)VB低溫組中自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ，Atg7，pULK-1(Ser777)以及Beclin-1表達(dá)水平較

13、FVB常溫組顯著上升(P＜0.05)， LC3B-Ⅱ toLC3B-Ⅰ比率和pULK-1(Set777)toULK1比率較FVB常溫組亦明顯上調(diào)(P＜0.05)，p62的蛋白表達(dá)量變化差異不明顯(P＞0.05)，在MT低溫組，低溫引起的上述變化被顯著抑制（P＜0.05）。自噬相關(guān)信號(hào)通路蛋白中，F(xiàn)VB低溫組Akt，mTOR，eNOS的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，金屬硫蛋白可以減輕低溫誘導(dǎo)的磷酸化降低趨勢(shì)。低溫對(duì)于AMPK，p70

14、S6K磷酸化影響不大。熒光免疫組化檢測(cè)FVB低溫組LC3B表達(dá)量明顯上調(diào)，MT低溫組和給予自噬抑制劑的FVB低溫組具有相似的LC3B表達(dá)量。免疫共沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫可以誘導(dǎo)Bcl-2和Bcelin-1解聚。單個(gè)心肌細(xì)胞收縮功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低溫可以顯著降低心肌細(xì)胞收縮峰值(Peak shortening，PS)，最大收縮速率(+dL/dt)，最大舒張速率(-dL/dt)，延長(zhǎng)舒張至90％的時(shí)間(time-to-90％ relengthening

15、，TR90)，自噬抑制劑3-MA和溶酶體抑制劑Bafilomycin A1均可緩解上述低溫誘導(dǎo)所致的單個(gè)心肌細(xì)胞收縮功能不足。FVB常溫組與MT常溫組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:低溫可以顯著增強(qiáng)心肌細(xì)胞的自噬作用并造成心肌收縮功能不足，金屬硫蛋白可以抑制低溫誘導(dǎo)所致的自噬增強(qiáng)，緩解心肌收縮功能不足。說(shuō)明重金屬清除劑金屬硫蛋白可以通過(guò)抑制心肌細(xì)胞自噬作用達(dá)到減輕低溫誘導(dǎo)所致的心肌收縮功能不足的效果。、
　　第三部分重金屬

16、清除劑金屬硫蛋白通過(guò)抑制氧化應(yīng)激作用改善低溫誘導(dǎo)所致的心肌收縮功能不足
　　目的:探討重金屬清除劑金屬硫蛋白是否可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激作用改善低溫誘導(dǎo)所致的心肌收縮功能不足。
　　方法:用常溫和低溫下飼養(yǎng)3周后的FVB小鼠和MT轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的表達(dá)水平，檢測(cè)還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的表達(dá)水平，用蛋白碳化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)蛋

17、白碳化水平。用常溫下和低溫下飼養(yǎng)3周后的FVB小鼠分離心肌細(xì)胞，分別體外給予抗氧化劑Nacetylcysteine(NAC，500μM，4小時(shí))，自噬抑制劑3-MA(10mM，4小時(shí)，作為陽(yáng)性對(duì)照)，用SoftEdge MyoCam system(IonOptix，Milton，MA，USA)分別檢測(cè)六組單個(gè)心肌細(xì)胞的收縮功能，用蛋白印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)微管相關(guān)蛋白LC3B，p62的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:低

18、溫飼養(yǎng)3周后，F(xiàn)VB低溫組中小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的表達(dá)量明顯上升（P＜0.05），氧化型谷胱甘肽(GSSG)表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比率（GSH/GSSG Ratio）明顯降低（P＜0.05），蛋白碳化水平亦明顯上升(P＜0.05)。金屬硫蛋白可以明顯改善上述低溫誘導(dǎo)所致的改變。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NAC和3-MA均可顯著減輕低溫誘導(dǎo)所致的LC3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ-to-LC3B-Ⅰ比率上升，

19、但對(duì)p62的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。單個(gè)心肌細(xì)胞收縮功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)收縮峰比例(PS)，最大收縮速率(+dL/dt)，最大舒張速率(-dL/dt)降低，舒張至90％的時(shí)間(TR90)延長(zhǎng)，NAC和3-MA均可緩解上述低溫誘導(dǎo)所致心肌收縮功能不足。FVB常溫組與MT常溫組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:在低溫誘導(dǎo)下，心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激活動(dòng)增強(qiáng)，蛋白碳化增加，金屬硫蛋白可以抑制氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，抑制蛋白碳化增加，說(shuō)明重金屬清除劑金屬硫蛋白可以通