DNA分子水平的“羅布麻”分類、遺傳多樣性及種質(zhì)鑒定研究.pdf

1、本論文選取分布于中國各地有爭議的三個分類群的“羅布麻”植物樣本作為實驗材料，采用改進Qiagen法從干燥和標本葉片中提取到完整的基因組DNA，運用ITS、tmL內(nèi)含子與trnL-F間隔區(qū)以及RAPD等分子標記技術探討我國三種“羅布麻”的問題和親緣關系：利用PCR產(chǎn)物直接測序法和RAPD-SCAR法分別對羅布麻及其易混品進行分子鑒定；并對羅布麻和大葉白麻野生居群分別進行RAPD遺傳多樣性分析。主要研究內(nèi)容和結果如下： 1.不同保存

2、狀態(tài)“羅布麻”葉片基因組DNA的提取參照從乙醇保存的動物樣本中提取基因組DNA的方法，采用Qiagon植物基因組DNA提取試劑盒，并在核裂解之時加入木瓜蛋白水解酶37℃溫浴振蕩水解12小時，以去除蛋白質(zhì)釋放DNA，后續(xù)步驟按照Qiagen說明書的方法。按照這一方法從不同生長季節(jié)(取材時間從2005年7 月～2005年10月)與不同貯存方法(硅膠干燥、自然干燥與18年前的常規(guī)壓制標本葉片)的三種“羅布麻”葉片中均提取出完整的基因組DNA。

3、 2.“羅布麻”的分類問題與親緣關系研究(1)測定了羅布麻、白麻和大葉白麻的核糖體DNA ITS序列、葉綠體trnL內(nèi)含子與trnL-F間隔區(qū)序列，并結合GenBank中相關屬種植物的ITS、tmL內(nèi)含子與trnL-F間隔區(qū)(含外類群)對我國產(chǎn)“羅布麻”的系統(tǒng)分類問題進行了分析。結果表明：羅布麻、白麻和大葉白麻都應屬于羅布麻屬，而且它們之間的親緣關系較羅布麻屬內(nèi)其他植物種間的親緣關系更近。(2)對來源于9個省份的10個羅布麻居群

4、樣本和3個省份的5個大葉白麻居群樣本進行RAPD-PCR檢測，分析羅布麻和大葉白麻種間和居群間的遺傳距離、相似度、多樣性指數(shù)，并進行系統(tǒng)聚類，結果顯示，羅布麻和大葉白麻的親緣關系超出了同一個種內(nèi)不同居群間的關系，應為羅布麻屬(Apocynum)內(nèi)親緣關系較近的兩個種。 3.羅布麻及其近緣相似種的分子鑒定研究(1)利用PCR產(chǎn)物直接測序法對羅布麻及其易混品大葉白麻和(Apoacnum cannabinum)的核基因組(rDNA)I

5、TS區(qū)與葉綠體基因組(cpDNA)trnL內(nèi)含子及trnL-F間隔區(qū)序列進行比對。結果顯示:羅布麻和大葉白麻ITS序列完全一致，與A.cannabinum在ITS1區(qū)有13個位點、在ITS2區(qū)有10個位點不同；在trnL內(nèi)含子區(qū)及trnL-F間隔區(qū)，羅布麻和大葉白麻共有3個位點不同，羅布麻和A.cannabinum間共有23個位點、大葉白麻和A. cannabinum間共有20個位點不同。研究表明，依據(jù)ITS區(qū)序列可鑒別A.ca

6、nnabinum和國產(chǎn)“羅布麻”(羅布麻與大葉白麻)；利用trnL內(nèi)含子及trnL-F間隔區(qū)序列可鑒別羅布麻、大葉白麻和A.cannabinum。(2)用80條RAPD隨機引物對羅布麻和大葉白麻不同居群樣本擴增，篩選出兩條羅布麻特異片段B08-407和B03.1368；片段經(jīng)克隆測序，并根據(jù)所測序列設計SCAR引物，其中B03-1368SCAR引物在退火溫度59℃時，將羅布麻和大葉白麻簡便、準確鑒別開來，將此SCAR標記命名為SCB03

7、-1368。 4.羅布麻與大葉白麻野生居群遺傳多樣性分析(1)利用RAPD分子標記技術對采自我國8個省份的9個羅布麻野生居群的遺傳多樣性進行檢測。結果表明，羅布麻具有較高的遺傳多樣性水平，遺傳分化主要發(fā)生在居群間。居群間遺傳距離與聚類結果顯示各居群間的親緣關系與地理分布和環(huán)境特征有一定的相關性。根據(jù)引物B03產(chǎn)生的標記識別碼可以有效鑒別羅布麻9個居群。(2)對分布于新疆、甘肅和青海三地的5個大葉白麻野生居群進行RAPD遺傳多樣性