淫羊藿苷—骨粉-聚乳酸復(fù)合材料的制備及其生物相容性.pdf

1、以骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein, BMP)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)為代表的成骨誘導(dǎo)因子價(jià)格昂貴，理化性質(zhì)不穩(wěn)定性，且具有潛在的致異位骨化和成腫瘤作用，在一定程度上限制了其在骨組織工程中的應(yīng)用，尋找一種安全有效、價(jià)格低廉的骨誘導(dǎo)因子成為了骨組織工程研究的客觀要求。中藥淫羊藿是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，具有較高的保健和藥用價(jià)值，其藥用單體

2、成分淫羊藿苷已被應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松等病癥。由于淫羊藿苷價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、可耐受消毒和滅菌，并被證明可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，已被初步用于骨組織工程的研究，但其是否能夠誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化還不明確。骨粉是天然的生物衍生材料，主要成分為羥基磷灰石，經(jīng)脫脂脫蛋白處理后，其抗原性被消除。聚乳酸是一種人工合成的高分子材料，具有良好的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。這兩類材料來源豐富，復(fù)合制備后可相互彌補(bǔ)彼此的不足

3、，在功能適應(yīng)性、組織相融性、生物降解性、力學(xué)性能上優(yōu)于人工合成的單一材料。
　　本文立足于目前骨缺損治療和研究中存在的問題，選用中藥淫羊藿苷，通過生物材料制備技術(shù)，構(gòu)建具有加速骨修復(fù)功能的中藥淫羊藿苷-骨粉/聚乳酸骨組織工程支架材料，并對(duì)其理化性質(zhì)和生物學(xué)性能進(jìn)行了研究。
　　人脂肪干細(xì)胞(human Adipose-Derived Stem Cells, hADSCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定:成年女性外科患者經(jīng)知情同意后，取腹

4、部切除脂肪組織500 mg，經(jīng)胰蛋白酶和膠原酶消化后進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增和傳代。鏡下觀察各代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并對(duì)第5代細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線和進(jìn)行成脂、成軟骨和成骨三向誘導(dǎo)。結(jié)果表明:原代培養(yǎng)的細(xì)胞24 h開始貼壁，初為短梭形，細(xì)胞大小不等;隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)速度變快，呈旋渦狀螺旋生長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸被純化，形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形。第5代培養(yǎng)的細(xì)胞在第4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第9d后細(xì)胞處于平臺(tái)期;經(jīng)三向誘導(dǎo)后可分別向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化。

5、　　淫羊藿苷對(duì)人脂肪干細(xì)胞成骨分化的影響:配制10-9M～1.0×10-3M的淫羊藿苷培養(yǎng)基，并以此培養(yǎng)第5代hADSCs，用CCK-8法研究不同濃度淫羊藿苷對(duì)細(xì)胞黏附、增殖的影響，探討淫羊藿苷的細(xì)胞毒性。為明確淫羊藿苷對(duì)hADSCs增殖的影響，將細(xì)胞以2×103細(xì)胞/孔（低密度）接種后用10-9M～1.0×10-5M的淫羊藿苷培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。將細(xì)胞以2×107細(xì)胞/孔（高密度）接種，用10-9M～1.0×

6、10-5M的淫羊藿苷培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)hADSCs的成骨分化作用。結(jié)果表明:淫羊藿苷的細(xì)胞毒性隨藥物濃度的增加而增大，10-3M、10-4M的細(xì)胞毒性為2級(jí)，10-9M～10-5M細(xì)胞毒性均為1級(jí);10-9M可明顯促進(jìn)細(xì)胞增;10-5M～10-8M濃度的淫羊藿苷可誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向成骨分化，堿性磷酸酶染色呈陽性，且最佳的成骨誘導(dǎo)濃度為10-7M。
　　骨粉/PLA支架材料的制備及其細(xì)胞黏附特性:將檢疫合格的市售新鮮豬骨剔

7、除骨膜、骨髓后，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm規(guī)則小塊，用甲醇和氯仿脫脂48 h;10％的雙氧水脫蛋白24 h，反復(fù)沖洗后烘箱干燥。機(jī)械碾磨方法將骨塊處理成顆粒狀，制備脫脂脫蛋白骨粉。激光粒度分析儀檢測(cè)骨粉的粒度分布;紅外分光譜儀分析脫脂脫蛋白骨粉的成分，掃描電鏡觀察骨粉表面結(jié)構(gòu)。采用溶液澆鑄/粒子瀝出法制備骨粉/PLA支架材料，比較hADSCs在PLA及骨粉/PLA兩種支架上黏附率的不同。結(jié)果表明:脫脂脫蛋白骨粉的主要成

8、分為羥基磷灰石和碳酸鈣，中位徑為30.77μm，表面多突起，細(xì)胞在PLA和骨粉/PLA支架上的黏附率分別為47.71％和53.22％，存在顯著性差異(P＜0.05)。
　　淫羊藿苷-骨粉/PLA支架材料的制備及其理化性質(zhì):準(zhǔn)確稱取一定量的淫羊藿苷溶于無水乙醇并與骨粉預(yù)混，再以骨粉為藥物載體與10％ PLA溶液混合，超聲分散，將所得混合物倒入鋪滿石蠟微球的模具中，1200 rpm離心10min，真空干燥24 h。將支架取出，切成厚度

9、為1mm的支架，放入環(huán)己烷溶液中，氣浴震蕩72 h，每12h換液，洗去支架中的石蠟微球。于40℃真空干燥，制得載藥量分別為10-5M、10-6M、10-7M和10-8M的ICA-骨粉/PLA復(fù)合材料。經(jīng)理化檢測(cè)，結(jié)果表明:骨粉/PLA材料的孔隙率、孔徑分別為(91.52±3.27)％和200～300μm;加入中藥后ICA-骨粉/PLA材料孔隙率有所下降，但仍大于85％，孔徑為200～300μm; FTIR檢測(cè)表明淫羊藿苷載藥過程并未影響

10、骨粉/PLA材料的化學(xué)性質(zhì)。
　　淫羊藿苷-骨粉/PLA支架材料的生物相容性:考察淫羊藿苷-骨粉/PLA支架材料的細(xì)胞毒性和材料浸提液對(duì)hADSC成骨分化的影響，第5代hADSCs接種至24孔板，5×105細(xì)胞/孔，每組6孔，待hADSCs貼壁24 h后吸掉原培養(yǎng)基，加入1mL完全培養(yǎng)基，再于孔內(nèi)分別加入10-5M、10-6M和107M ICA-骨粉/PLA材料，以骨粉/PLA材料作為對(duì)照。37℃，5％ CO2孵箱培養(yǎng)，每2d換液

11、1次，于第7d進(jìn)行顯微鏡拍照觀察。同樣的方法用材料浸提液研究支架對(duì)hADSCs成骨分化的影響，各組ALP染色以及檢測(cè)各組細(xì)胞ALP含量。經(jīng)觀察可知，共培養(yǎng)48 h后細(xì)胞無明顯死亡、漂浮等跡象，共培養(yǎng)7d的ALP染色表明:生長(zhǎng)在3個(gè)載藥劑量上的ICA-骨粉/PLA支架材料上的細(xì)胞變?yōu)槎趟笮秃推渌灰?guī)則形狀，細(xì)胞表面可見大量分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，并逐漸出現(xiàn)聚集樣生長(zhǎng)，ALP染色細(xì)胞數(shù)量多、顏色深，其中10-7M ICA-骨粉/PLA材料ALP染