攜帶骨粉的明膠-聚己內(nèi)酯靜電紡纖維膜支架材料的制備及其生物相容性研究.pdf

1、目的:外傷、骨感染、骨腫瘤等疾病造成的缺損，需要進(jìn)行骨的修復(fù)重建。臨床上，通過(guò)骨移植的手段可以為機(jī)體提供機(jī)械力學(xué)支撐并促進(jìn)骨的再生。利用靜電紡絲計(jì)技術(shù)，制備多孔、仿生骨組織工程支架;通過(guò)透射電鏡及掃描電鏡手段檢測(cè)所制備支架的結(jié)構(gòu)特征;利用酶消化法提取SD大鼠腹股溝脂肪組織中的脂肪源性干細(xì)胞，并將干細(xì)胞與所制備的支架材料進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，以研究所制備的支架材料的生物相容性;以期通過(guò)此研究獲得生物相容性好、具有多孔特征、適合ADSCs生長(zhǎng)、粘附

2、和增殖的骨組織工程支架，并指導(dǎo)其后續(xù)基礎(chǔ)及臨床研究。
　　方法:1、利用全自動(dòng)冷凍研磨儀制備天然骨粉;明膠和聚己內(nèi)酯按10％的比重分別溶入三氟乙醇中，獲得均勻的明膠和聚己內(nèi)酯溶液，按1∶1的比例進(jìn)行混合，得到了混合溶液A;在溶液A的基礎(chǔ)上，我們加入10％的納米羥基磷灰石，得到溶液B;另外，在混合溶液A的基礎(chǔ)上，加入10％的骨粉，我們得到了溶液C。通過(guò)靜電紡絲技術(shù)，將三種溶液制備成納米纖維膜支架，消毒后備用。
　　2、支架材料

3、的表征檢測(cè):分別取適量的骨粉和納米羥基磷灰石行掃描電鏡檢測(cè)。將三種靜電紡絲所制備的支架材料分別切取小片，行掃描電鏡檢測(cè)。在靜電紡絲過(guò)程中用銅網(wǎng)膜收集三組材料的電紡纖維，作為透射電鏡檢測(cè)標(biāo)本，行透射電鏡檢測(cè)。
　　3、脂肪源性干細(xì)胞的分離及培養(yǎng):利用酶消化法分離SD大鼠腹股溝脂肪組織內(nèi)的脂肪源性干細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選用第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　5、掃面電鏡檢測(cè):細(xì)胞與材料共培養(yǎng)2天后，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基中分別取出材

4、料。用梯度乙醇脫水，將樣品放入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干，最后將得到的樣品送掃描電鏡檢測(cè)。
　　6、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):將直徑大小為6mm的三種材料分別放入96孔板中，隨后將細(xì)胞接種在96孔板的材料上進(jìn)行培養(yǎng)。應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(12h，24h，48h，72h)的增殖情況，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度OD值。
　　7、細(xì)胞活力檢測(cè):首先高溫高壓消毒瓊脂糖溶液，在凝固之前，向使用的24孔板中分別加入瓊脂糖，鋪滿

5、培養(yǎng)板底部，以防止脂肪源性干細(xì)胞在培養(yǎng)板底面粘附。隨后將直徑大小為8mm的三種支架材料分別放入24孔板中。將脂肪源性干細(xì)胞接種在各組材料上，培養(yǎng)48小時(shí)后，取各組材料按活死染色試劑盒說(shuō)明，對(duì)材料上的脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行染色。在倒置熒光顯微鏡下觀察，并隨機(jī)拍攝照片。最后我們應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件對(duì)材料上的活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　8、統(tǒng)計(jì)分析:每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行了至少三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲得的數(shù)據(jù)分別用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所獲得

6、的數(shù)據(jù)分別用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用方差分析方法來(lái)檢測(cè)各組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P＜0.05被認(rèn)定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、我們實(shí)驗(yàn)中的骨粉達(dá)到了微米和納米大小級(jí)別，形狀不規(guī)則。從SIGMA公司購(gòu)買(mǎi)的納米羥基磷灰石顆粒直徑小于200nm，形狀為圓球形。通過(guò)靜電紡絲技術(shù)，我們成功地制備了三種支架材料，即明膠/聚己內(nèi)酯纖維膜，明膠/聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜，以及明膠/聚己內(nèi)酯/骨粉纖維膜。并且納米羥基磷灰石和骨粉

7、分別被成功地結(jié)合到了明膠/聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜和明膠/聚己內(nèi)酯/骨粉纖維膜的纖維內(nèi)部。
　　2、當(dāng)納米羥基磷灰石和骨粉被結(jié)合到明膠/聚己內(nèi)酯纖維內(nèi)之后，纖維的直徑變得更細(xì)，并且三組材料中，明膠/聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜組纖維最細(xì)。三組支架材料內(nèi)部的纖維直徑大小皆成正態(tài)分布。三組支架材料內(nèi)部纖維直徑大小存在顯著差別(P＜0.001)。明膠/聚己內(nèi)酯纖維膜組纖維直徑最大，明膠/聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜組纖維直徑最

8、小，明膠/聚己內(nèi)酯/骨粉纖維膜組纖維直徑大小居中。
　　3、通過(guò)酶消化法能夠成功地分離出了SD大鼠腹股溝脂肪組織中脂肪源性干細(xì)胞。脂肪源性干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　4、脂肪源性干細(xì)胞皆均覆蓋在多孔復(fù)合支架材料的表面，并通過(guò)偽足向材料的內(nèi)部延伸。明膠/聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜和明膠/聚己內(nèi)酯/骨粉纖維膜上的細(xì)胞較多，并且細(xì)胞之間相互靠近。
　　5、在ADSCs與纖維膜共培養(yǎng)的前24小時(shí)，明膠/聚己內(nèi)酯纖維膜、明膠/

9、聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜和明膠/聚己內(nèi)酯/骨粉纖維膜三組材料上脂肪源性干細(xì)胞的增殖情況無(wú)明顯差異，三組OD值皆低于對(duì)照組。但是在24小時(shí)后，細(xì)胞皆增殖到較高水平，而且，明膠/聚己內(nèi)酯/骨粉纖維膜組細(xì)胞增殖速度超過(guò)了對(duì)照組。在48小時(shí)后，明膠/聚己內(nèi)酯/骨粉纖維膜組OD值高于對(duì)照組。
　　6、脂肪源性干細(xì)胞在三組材料上分布均勻，而且材料上的細(xì)胞主要被染成綠色，紅色細(xì)胞較少。各組之間的活細(xì)胞數(shù)量存在明顯差異，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義(P＜0.05)，明膠/聚己內(nèi)酯纖維膜上活細(xì)胞最少，明膠/聚己內(nèi)酯/骨粉纖維膜上活細(xì)胞最多，而明膠/聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜上的活細(xì)胞數(shù)量居中。
　　結(jié)論:1、通過(guò)靜電紡絲技術(shù)，天然骨粉能夠通過(guò)靜電紡絲技術(shù)成功地結(jié)合到明膠/聚己內(nèi)酯纖維內(nèi)。
　　2、攜帶骨粉的gelatin/PCL纖維膜具有良好的生物相容性，是一種較為理想的組織工程支架。
　　3、攜帶骨粉的gelatin/PCL電紡纖維膜的制備及其生物相容性研