利用RNAi分析水稻化感作用關(guān)鍵酶PAL基因的功能.pdf

1、為證實(shí)水稻化感作用的功能性狀與PAL基因功能之間的相關(guān)性，揭示水稻化感作用的分子生態(tài)學(xué)過(guò)程與機(jī)制，以強(qiáng)化感水稻品種PI312777為材料，從化感水稻PI312777植株中提取基因組DNA，根據(jù)GenBank中PAL基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成RNAi引物，PCR擴(kuò)增出PAL基因片段并克隆到pMD-18 T easy載體，測(cè)序確定其正確性，獲得PAL基因320bp序列。再將PAL基因片段(320bp)正反向連接于載體PTCK-303內(nèi)含子兩端

2、，構(gòu)建成RNAi表達(dá)載體PTCK303-S-A，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，對(duì)水稻進(jìn)行GUS染色，PCR檢測(cè)，證明外源基因已經(jīng)成功整合到水稻基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果：轉(zhuǎn)基因正常氮與低氮PI葉組織中的PAL基因表達(dá)量是對(duì)照未轉(zhuǎn)基因正常氮，低氮PI葉組織中PAL基因表達(dá)量的70％與75％，轉(zhuǎn)基因正常氮與低氮PI葉組織中的PAL基因干擾效率分別為30％與25％。與對(duì)照未轉(zhuǎn)基因正常氮下相比，對(duì)照未轉(zhuǎn)基因低氮下PI葉組織中

3、的PAL基因上調(diào)表達(dá)2.12倍。轉(zhuǎn)基因低氮P工葉組織的PAl?；蛞采险{(diào)表達(dá)，與轉(zhuǎn)基因正常氮下相比上調(diào)2.32倍。PAL酶活性檢測(cè)結(jié)果：轉(zhuǎn)基因正常氮PI水稻PAL酶活性下調(diào)，與未轉(zhuǎn)基因正常氮P工水稻PAL酶活性相比降低64％，說(shuō)明PAL基因被干擾。在不同氮素條件下水稻抑草潛力的變化結(jié)果：在源于轉(zhuǎn)基因PI312777正常氮處理液中培養(yǎng)的稗草，其稗草干物重均大于未轉(zhuǎn)基因PI312777、Lemont正常氮處理液培養(yǎng)的稗草的對(duì)應(yīng)值，其抑制率則