過(guò)表達(dá)ANT1基因?qū)︻i總動(dòng)脈球囊損傷SD大鼠血管內(nèi)膜增生的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 自上世紀(jì)70年代以來(lái)，包括經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(Percutaneous coronaryintervention，PTCA)、經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)旋切術(shù)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架植入術(shù)等技術(shù)在內(nèi)的經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous coronary intervention，PCI)已經(jīng)成為臨床上治療冠心病的主要手段，但術(shù)后再狹窄(Restenosis，RS)的高發(fā)生率嚴(yán)重影響了PCI手術(shù)效果。相關(guān)研究表明

2、，使用PTCA和裸支架(Bare metal stent，BMS)植入術(shù)治療冠心病，RS的發(fā)生率在20-30%以上[1]。雖然近年來(lái)藥物洗脫支架(Drug eluting stent，DES)的應(yīng)用以及術(shù)后藥物支持治療方法的進(jìn)步使RS的發(fā)生率明顯下降，但依然保持在5-10%左右，伴有糖尿病的患者則更高[2]。目前對(duì)于再狹窄發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不明確。通常認(rèn)為，PCI術(shù)后再狹窄主要是由于手術(shù)過(guò)程中血管內(nèi)皮剝脫和血管內(nèi)膜下出血激發(fā)的一系列炎

3、癥反應(yīng)所導(dǎo)致。在血管損傷基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)臨床、生物學(xué)以及遺傳學(xué)相關(guān)RS危險(xiǎn)因素的影響，炎癥反應(yīng)激活，血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和凋亡失衡，大量細(xì)胞外基質(zhì)合成，最終導(dǎo)致內(nèi)膜過(guò)度增生[3，4]。因此，研究促進(jìn)VSMC凋亡和抑制損傷后血管VSMC過(guò)度增殖對(duì)防治再狹窄具有重要的意義。
　　 腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(Adenine nucleotide translocase，ANT

4、)是一類位于線粒體內(nèi)膜的跨膜蛋白，參與構(gòu)成線粒體膜通道性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(Mitochondrial permeability transitionpore，mPTP)。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)開(kāi)放，使線粒體功能失衡，線粒體膜電位(△ψm)降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。ANT的跨膜結(jié)構(gòu)域分為基質(zhì)構(gòu)象(m-構(gòu)象)和胞質(zhì)構(gòu)象(c-構(gòu)象)兩部分，兩種構(gòu)象可通過(guò)與ADP、ATP等底物結(jié)合而相互轉(zhuǎn)換，而使mPTP開(kāi)放或關(guān)閉。Shen[5]等在細(xì)胞凋亡模式生物秀麗線蟲(chóng)

5、模型上研究發(fā)現(xiàn)WAN-1是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，而WAN-1與哺乳動(dòng)物的ANT-1同源。有研究表明過(guò)表達(dá)ANT1可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡，甚至縮小腫瘤體積[6，7]。其作用機(jī)制可能與ANT1作為mPTP重要組成部分有關(guān)，引起線粒體膜電位降低，從而觸發(fā)線粒體通路的細(xì)胞凋亡[8]。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)在體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)ANT1可以誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)Bax表達(dá)，使Bax/Bcl-2比例繼發(fā)升

6、高有關(guān)[9]。因此，本課題利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建的攜帶有ANT1基因的重組腺病毒感染頸總動(dòng)脈球囊損傷再狹窄SD大鼠模型，通過(guò)RT-PCR、Western-Blotting、免疫組化和TUNEL法原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)ANT1基因?qū)υ侏M窄大鼠模型球囊損傷后頸總動(dòng)脈VSMCs的影響和內(nèi)膜的增生情況，探討ANT1能否作為PCI術(shù)后再狹窄防治的新靶點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)采用的包含有ANT1基因的重組腺病毒由本實(shí)

7、驗(yàn)室李燕碩士提供，滴度為2×1011PFU/ml，可以用動(dòng)物載體轉(zhuǎn)染。
　　 2、以健康雄性7周齡SD大鼠72只，體重280-300g，構(gòu)建頸總動(dòng)脈球囊損傷SD大鼠模型。分為假手術(shù)組、單純球囊損傷組、Ad-ANT1腺病毒轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP空病毒轉(zhuǎn)染組，每組18只。除假手術(shù)組外，其余三組在球囊損傷剝脫血管內(nèi)皮后，分別向頸總動(dòng)脈注入PBS緩沖液、Ad-GFP空載體腺病毒液和Ad-ANT1腺病毒液約40μl，作用30 min后，吸出

8、病毒液，生理鹽水沖洗管腔。
　　 3、分別在轉(zhuǎn)染后7d、14d、28d麻醉處死各組SD大鼠模型，取損傷側(cè)頸總動(dòng)脈，剪取約0.5cm用于制作石蠟切片，HE染色評(píng)價(jià)血管內(nèi)膜增生情況；TUNEL法檢測(cè)頸總動(dòng)脈細(xì)胞凋亡率；免疫組化檢測(cè)Bax和Bcl-2表達(dá)情況。
　　 4、損傷側(cè)頸總動(dòng)脈除制作切片外的余下部分用于提取總RNA和總蛋白。利用RT-PCR和Western Blotting方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組頸總動(dòng)脈Bax和Bcl-2的m

9、RNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建頸總動(dòng)脈球囊損傷血管再狹窄大鼠模型，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2、成功利用Ad-ANT1重組腺病毒載體將ANT1基因轉(zhuǎn)染頸總動(dòng)脈球囊損傷SD大鼠模型，RT-PCR顯示Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和頸總動(dòng)脈單純損傷組比較，ANT1mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯增高。
　　 3、頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生情況：Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組內(nèi)膜/中膜面積比

10、(IA/MA)與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和頸總動(dòng)脈單純損傷組相比明顯減小。
　　 4、頸總動(dòng)脈細(xì)胞凋亡情況：TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和頸總動(dòng)脈單純損傷組比較，平滑肌細(xì)胞凋亡率顯著提高。
　　 5、免疫組化、RT-PCR和Western Blotting結(jié)果顯示Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和頸總動(dòng)脈單純損傷組比較，Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯提高，而B(niǎo)cl-2mRNA和蛋白