17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮對心肌缺血的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、玉郎傘[Millettia pulchra Kurz var laxior(Dunn)Z.Wei，LYS]是廣西壯族的特色藥材，具有廣泛的心血管藥理活性，本課題組對其進(jìn)行了長期深入的研究，17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮(17-methoxyl-7-hydroxy-benzfuranchalcon，YLSC)是從玉郎傘中提取的黃酮類新化合物，其分子式為C18H14O4，分子量為294.3，已授權(quán)1項國家發(fā)明專利(200710034

2、771.2)。我們體外的研究證實，YLSC具有較強(qiáng)的清除自由基、耐缺氧、抗凝血能力，對H2O2及缺氧/復(fù)氧所致的心肌細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抗氧化、抗凝血作用，保護(hù)Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，增加T-SOD、GSH、cNOS、tNOS活性，減少MDA、LDH、iNOS的產(chǎn)生等途徑有關(guān)。但YLSC對整體動物是否有效，尚不清楚。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，研究YLSC對垂體后葉素和缺血再灌注致大鼠心

3、肌缺血的影響，以評價YLSC的藥效，為進(jìn)一步研究YLSC作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
　　第一部分17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮對垂體后葉素致大鼠心肌缺血的保護(hù)作用
　　目的:觀察17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮(YLSC)對垂體后葉素致心肌缺血大鼠的影響。方法:將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只:正常對照組，模型對照組，溶媒組，陽性藥對照組，YLSC低、高劑量組(2.5，5.0 mg·

4、kg-1)。各組尾靜脈給予相應(yīng)藥物后，觀察垂體后葉素致心肌缺血大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖的變化，伊文思藍(lán)和三苯基氯化四氮唑(TTC)雙重染色確定心肌缺血面積，HE染色觀察心肌形態(tài)學(xué)變化，Elisa法檢測血清生化標(biāo)志物MB型肌酸激酶(CK-MB)、肌鈣蛋白(cTnⅠ)和肌紅蛋白(MyoG)的含量。結(jié)果:YLSC能劑量依賴性的減少大鼠15s，30s，1min，5min的ST段抬高，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01);同時能劑量依

5、賴性的縮小模型組心肌缺血面積(P＜0.05或P＜0.01)，減少心肌標(biāo)志物CK-MB，cTnⅠ，MyoG的漏出(P＜0.05或P＜0.01)，改善心肌水腫、出血和炎細(xì)胞滲出的狀況。結(jié)論:YLSC對垂體后葉素所致心肌缺血大鼠有明顯保護(hù)作用。
　　第二部分17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮預(yù)處理對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的:觀察17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮(YLSC)預(yù)處理對大鼠離體心臟缺血再灌

6、注損傷的影響。方法:將70只SD大鼠隨機(jī)分為7組，每組10只:正常對照組，缺血再灌注(I/R)組，溶媒組，缺血預(yù)處理(IPC)組，陽性組，YLSC低、高劑量組(5.0 mg·L-1，10.0 mg·L-1)。缺血30min，再灌注30min，記錄給藥前，再灌注5，10，20，30min的心率(HR)和左室收縮壓(LVSP)，并檢測冠脈流量(CF)和流出液中肌酸激酶(CK)的含量。實驗結(jié)束后計算心肌梗死面積，并檢測心肌組織中一氧化氮(NO

7、)，一氧化氮合成酶(NOS)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)的含量。
　　結(jié)果:YLSC能劑量依賴性的增加I/R組離體心臟再灌注后5，10，20，30min的CF，HR和LVSP(P＜0.05或P＜0.01)，改善心功能低下，同時能縮小缺血再灌注大鼠的心肌梗死面積(P＜0.01)，減少冠脈流出液中CK的含量(P＜0.05或P＜0.01)。與I/R組比較，YLSC預(yù)處理組MDA生成明顯減少，NO，NOS，SOD活性明顯升

8、高(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論:YLSC預(yù)處理對大鼠離體心臟缺血再灌注有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化，增加NO釋放有關(guān)。
　　第三部分17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的:觀察17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮(YLSC)對心肌缺血再灌注損傷大鼠的影響。方法:SD大鼠60只隨機(jī)分為6組，每組10只:假手術(shù)組，模型組，溶媒組，陽性藥地爾硫卓組（2.0 mg·kg-

9、1），YLSC低劑量組（2.5 mg·kg-1）、YLSC高劑量組（5.0mg·kg-1）。缺血30 min再灌注60min復(fù)制大鼠缺血再灌注(I/R)模型。觀察大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)如HR，MAP，LVEDP和±dp/dtmax的變化，測定心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)、Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)的含量。TUNEL法檢測心肌陽性細(xì)胞凋亡率，Wes

10、ternblot法檢測凋亡相關(guān)蛋白如凋亡信號調(diào)節(jié)蛋白1（apoptosis signal regulatingkinase1，ASK1）、細(xì)胞色素c(cytochrome c，cyt c)、Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)量，并計算Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的比值。結(jié)果:與模型組比較，YLSC能劑量依賴性的降低HR、MAP和±dp/dtmax，升高LVEDP(P＜0.05或P＜0.01);YLSC還能劑量依賴性的減少MDA的釋放，增加SOD

11、、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組相比，YLSC能明顯降低心肌細(xì)胞的凋亡率(P＜0.01);劑量依賴性的減少ASK1、cyt c、Bax蛋白的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)，增加Bcl-2蛋白的表達(dá)(P＜0.01);提高Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的比值(P＜0.01)。結(jié)論:YLSC能改善缺血再灌注大鼠的心功能，明顯減輕大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與抗氧化，保

12、護(hù)Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性，減少ASK1、cyt c、Bax蛋白表達(dá)，增加Bcl-2蛋白表達(dá)，升高Bcl-2/Bax比值有關(guān)。
　　第四部分17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用
　　目的:觀察17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮(YLSC)對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:采用差數(shù)貼壁法體外分離培養(yǎng)新生乳鼠心肌細(xì)胞，缺氧2h復(fù)氧

13、4h模擬心肌細(xì)胞A/R模型。實驗隨機(jī)分為正常對照組，A/R組，溶媒組，陽性藥地爾硫卓組（30μmol·L-1），YLSC低劑量組（75μg·m L-1），YLSC高劑量組(150μg·m L-1)。觀察心肌細(xì)胞形態(tài)和搏動頻率的變化，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm)及細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的變化，檢測心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，檢測心肌細(xì)胞L型鈣通道的α1e亞單位(Alp

14、hac subunit of L-type Ca2+ channels，Cav1.2)，鈉鈣交換蛋白(sodium-calcium exchanger，NCX)和肌漿網(wǎng)鈣泵-2a(SR calcium ATPase-2a，SERCA2a) mRNA和蛋白表達(dá)量的變化。檢測心肌細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素c(cytochrome c，cytc)、Bcl-2、Bax、caspase9和caspase3的表達(dá)。結(jié)果:A/R組心肌細(xì)胞心肌細(xì)

15、胞搏動明顯減慢，[Ca2+]i顯著增加，△Ψm、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著降低，Cav1.2和NCX表達(dá)升高，SERCA2a表達(dá)降低（與正常對照組比較，P＜0.05或P＜0.01）。YLSC可呈濃度依賴性顯著降低[Ca2+]i，增加△Ψm、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，降低Cav1.2和NCX表達(dá)（與A/R組比較，P＜0.05或P＜0.01），對SERCA2a表達(dá)無明顯影響。

16、與A/R組相比，YLSC明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率，增加心肌Bcl-2/Bax比值，阻止cytc釋放，減少caspase9，caspase3活性(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論:YLSC可以減輕A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞凋亡，這可能與其增強(qiáng)細(xì)胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，降低Cav1.2和NCX表達(dá)，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載和減少凋亡有關(guān)。
　　綜上所述，YLSC可能是通過清除自由基、減少心肌酶的漏出