STLV-1-BV重組蛋白ELISA診斷試劑盒的研發(fā)及液相芯片診斷方法的建立.pdf

1、猴T淋巴細胞白血病毒Ⅰ型(STLV-1)、猴單純皰疹病毒(BV)在國內(nèi)猴群中的感染率比較高，這不但影響動物健康和實驗研究的結果，而且對實驗接觸人員具有嚴重危害性。目前，分離、細胞培養(yǎng)病毒作為抗原是診斷這兩種疾病常用的方法，這對實驗人員有嚴重的危害性，而且成本相對較高。為了獲得更多的、對實驗操作人員沒有危害的抗原，本研究采用了體外化學合成猴T淋巴細胞白血病毒Ⅰ型(STLV-1)gag、單純皰疹病毒(BV)gd部分保守基因片段，經(jīng)大腸桿菌的

2、表達、親和層析純化，建立了STLV-1、BV的ELISA診斷方法，同時，建立了一種可以同時檢測兩種病毒抗體的液相芯片技術，這為以后的進一步實驗奠定了基礎。 本研究根據(jù)Genbank公布序列化學合成STLV-1gag、BV gd基因片段，經(jīng)酶切后將目的片段連接到表達載體pET15b中并進行測序鑒定。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達宿主菌BL21(DE3)中，經(jīng)小量優(yōu)化誘導表達條件后進行SDS-PAGE、Western B10t檢測表達量及表

3、達活性，經(jīng)蛋白質(zhì)活性鑒定及大小均正確的菌株進行大量(10L)發(fā)酵、純化得到重組蛋白STLV-1 gag和重組蛋白BV gd。然后以重組蛋白作為抗原檢測猴血清中相應抗體，并與現(xiàn)有商品化診斷試劑盒結果對比。同時，將重組蛋白STLV-1gag、重組蛋白BV gd作為探針偶聯(lián)到不同顏色(即不同編號)的熒光微球上對恒河猴血清中相應的抗體進行檢測，檢測結果與ELISA檢測結果進行對比。經(jīng)研究得到如下結果: 1.從化學合成的pJ-STLV-1

4、 gag、pJ-BV gd載體經(jīng)酶切獲得了目的片段STLV-1 gag(1323bp)，BV gd(1194bp)，然后將目的片段與表達載體pET15b連接，構建了重組表達質(zhì)粒pET15b-STLV-l gag、pET15b-BV gd。 2.經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主rosetta2 DE3 plysS中，小量誘導表達STLV-1gag、BV gd，優(yōu)化誘導表達條件后進行SDS-PAGE、Western Blot檢測表達

5、量及表達活性。結果表明，重組蛋白STLV-1 gag、重組蛋白BV gd在大腸桿菌中成功表達，STLV-1 gag重組蛋白以可溶形式存在于菌體中，BV gd重組蛋白以包涵體的形式存在。 3.10L發(fā)酵罐大量誘導大腸桿菌表達重組蛋白STLV-1 gag和重組蛋白BV gd，然后經(jīng)AKTA純化系統(tǒng)Ni2+親和層析純化得到重組蛋白STLV-1 gag和重組蛋白BV gd。 4.以重組蛋白STLV-1 gag為抗原檢測廣西某猴場

6、1304份恒河猴血清，陽性率為3.76％，重組蛋白BV gd作為抗原檢測514份恒河猴血清，陽性率為29.96％；現(xiàn)有商品化診斷試劑盒檢出陽性率分別為2.68％、21.60％。經(jīng)Western Blot確認檢測結果，重組蛋白檢出率明顯高于現(xiàn)有商品化診斷試劑盒(P<0.05)。因此重組蛋白STLV-1 gag和重組蛋白BV gd可以作為病毒良好的代替抗原，解決了通過分離、培養(yǎng)病毒獲取抗原的困難以及操作的危險性。同時，為猴群的凈化、SPF實