STLV-1-BV重組蛋白ELISA診斷試劑盒的研發(fā)及液相芯片診斷方法的建立.pdf

1、猴T淋巴細(xì)胞白血病毒Ⅰ型(STLV-1)、猴單純皰疹病毒(BV)在國(guó)內(nèi)猴群中的感染率比較高，這不但影響動(dòng)物健康和實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)接觸人員具有嚴(yán)重危害性。目前，分離、細(xì)胞培養(yǎng)病毒作為抗原是診斷這兩種疾病常用的方法，這對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有嚴(yán)重的危害性，而且成本相對(duì)較高。為了獲得更多的、對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員沒有危害的抗原，本研究采用了體外化學(xué)合成猴T淋巴細(xì)胞白血病毒Ⅰ型(STLV-1)gag、單純皰疹病毒(BV)gd部分保守基因片段，經(jīng)大腸桿菌的

2、表達(dá)、親和層析純化，建立了STLV-1、BV的ELISA診斷方法，同時(shí)，建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)兩種病毒抗體的液相芯片技術(shù)，這為以后的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 本研究根據(jù)Genbank公布序列化學(xué)合成STLV-1gag、BV gd基因片段，經(jīng)酶切后將目的片段連接到表達(dá)載體pET15b中并進(jìn)行測(cè)序鑒定。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，經(jīng)小量?jī)?yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后進(jìn)行SDS-PAGE、Western B10t檢測(cè)表達(dá)量及表

3、達(dá)活性，經(jīng)蛋白質(zhì)活性鑒定及大小均正確的菌株進(jìn)行大量(10L)發(fā)酵、純化得到重組蛋白STLV-1 gag和重組蛋白BV gd。然后以重組蛋白作為抗原檢測(cè)猴血清中相應(yīng)抗體，并與現(xiàn)有商品化診斷試劑盒結(jié)果對(duì)比。同時(shí)，將重組蛋白STLV-1gag、重組蛋白BV gd作為探針偶聯(lián)到不同顏色(即不同編號(hào))的熒光微球上對(duì)恒河猴血清中相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。經(jīng)研究得到如下結(jié)果: 1.從化學(xué)合成的pJ-STLV-1

4、 gag、pJ-BV gd載體經(jīng)酶切獲得了目的片段STLV-1 gag(1323bp)，BV gd(1194bp)，然后將目的片段與表達(dá)載體pET15b連接，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET15b-STLV-l gag、pET15b-BV gd。 2.經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主rosetta2 DE3 plysS中，小量誘導(dǎo)表達(dá)STLV-1gag、BV gd，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后進(jìn)行SDS-PAGE、Western Blot檢測(cè)表達(dá)

5、量及表達(dá)活性。結(jié)果表明，重組蛋白STLV-1 gag、重組蛋白BV gd在大腸桿菌中成功表達(dá)，STLV-1 gag重組蛋白以可溶形式存在于菌體中，BV gd重組蛋白以包涵體的形式存在。 3.10L發(fā)酵罐大量誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)重組蛋白STLV-1 gag和重組蛋白BV gd，然后經(jīng)AKTA純化系統(tǒng)Ni2+親和層析純化得到重組蛋白STLV-1 gag和重組蛋白BV gd。 4.以重組蛋白STLV-1 gag為抗原檢測(cè)廣西某猴場(chǎng)

6、1304份恒河猴血清，陽性率為3.76％，重組蛋白BV gd作為抗原檢測(cè)514份恒河猴血清，陽性率為29.96％；現(xiàn)有商品化診斷試劑盒檢出陽性率分別為2.68％、21.60％。經(jīng)Western Blot確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果，重組蛋白檢出率明顯高于現(xiàn)有商品化診斷試劑盒(P<0.05)。因此重組蛋白STLV-1 gag和重組蛋白BV gd可以作為病毒良好的代替抗原，解決了通過分離、培養(yǎng)病毒獲取抗原的困難以及操作的危險(xiǎn)性。同時(shí)，為猴群的凈化、SPF實(shí)