菠蘿蛋白酶的分離純化及部分應(yīng)用性質(zhì)的研究.pdf

1、為滿足醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)Ω呋钚愿呒兌炔ぬ}蛋白酶的大力需求，更進(jìn)一步了解菠蘿蛋白酶應(yīng)用的有關(guān)性質(zhì)，本試驗以菠蘿下腳料菠蘿皮為試驗原料，對菠蘿蛋白酶的分離純化、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、活性的應(yīng)用等方面進(jìn)行了初步研究，主要內(nèi)容如下：
　　 (1)利用硫酸銨分級沉淀結(jié)合CM Sepharose FF陽離子交換柱層析的方法對皮汁中所含的菠蘿蛋白酶進(jìn)行分離提純，以獲得試驗所需材料。對提取的菠蘿蛋白酶進(jìn)行研究結(jié)果表明，運用此法分離純化效果比較理想，洗脫峰上出現(xiàn)一

2、個主峰，酶活性峰位于峰肩部位，純化過程中該離子交換柱層析純化效果較為顯著，能去除色素，使純度提高35.1倍，經(jīng)純化后菠蘿蛋白酶的比活達(dá)9400U/mg，活力回收率為48.7[％]。
　　 (2)對菠蘿蛋白酶的部分性質(zhì)進(jìn)行研究結(jié)果表明，皮汁中菠蘿蛋白酶相對分子質(zhì)量為28800Da，純酶液在280nm處有明顯的特征吸收峰。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果顯示單一條帶，表明其純度已達(dá)到電泳純。通過測定溫度對菠蘿蛋白酶酶活的影響可知

3、，菠蘿蛋白酶的最適溫度為55～65℃，在60℃時活性最高。此酶在pH 7.5近中性環(huán)境中，酶活性最高。處于偏酸性(pH<7.0)環(huán)境中，酶反應(yīng)速度下降快；在偏堿性(pH>7.5)的環(huán)境中，菠蘿蛋白酶活性逐漸下降。通過測定金屬離子對酶活的影響可知，二價鐵離子對菠蘿蛋白酶有明顯的激活作用，鋅離子和銅離子的作用次之，在濃度較低時對菠蘿蛋白酶表現(xiàn)一定的激活作用，分別比對照提高了31.9[％]、18.2[％]，但當(dāng)濃度較大時反而起抑制作用。增加N

4、aCl對菠蘿蛋白酶也能起到一定的保護(hù)作用、KCl對酶反應(yīng)影響不大，而MgSO4·7H2O和無水CaCl2對菠蘿蛋白酶活性均有一定程度的抑制作用。在模擬豬胃條件下pH2.5胃蛋白酶對菠蘿蛋白酶影響較大，37℃保溫處理2h、3h后，菠蘿蛋白酶的活性損失分別為49.2[％]、61.9[％]。經(jīng)IR圖譜分析顯示此酶具有蛋白質(zhì)的特征吸收峰，但結(jié)構(gòu)基團(tuán)與Sigma公司的莖酶標(biāo)準(zhǔn)品比較稍有不同。
　　 (3)在K88陽性產(chǎn)腸毒素大腸桿菌對小腸

5、上皮細(xì)胞的黏附試驗中，感染組1的黏附率最低，作用效果最好。空白對照組中大腸桿菌對小腸上皮細(xì)胞的黏附率在相互作用的前三個小時內(nèi)平均達(dá)90.6[％]，經(jīng)菠蘿蛋白酶處理的小腸上皮細(xì)胞再加K88+ETEC大腸桿菌感染時，在培養(yǎng)的前兩個小時未見有黏附，在第3h待菠蘿蛋白酶的活性有所降低時，有1.85[％]的黏附率。在感染組2中，大腸桿菌細(xì)胞壁經(jīng)菠蘿蛋白酶水解作用后，其黏附小腸上皮細(xì)胞的能力在1h、2h、3h內(nèi)較空白對照分別降低31.79[％]、5