天然彩色棉纖維色素物質(zhì)的鑒定及其代謝機(jī)制研究.pdf

1、目的：天然彩色棉是一種成熟纖維具有天然色彩的棉花，其健康、環(huán)保的特性迎合了市場的需求，具有廣闊的發(fā)展前景。但是，天然彩色棉色彩單調(diào)、色素遺傳不穩(wěn)定等嚴(yán)重制約了彩色棉的開發(fā)和利用。由于缺乏除棕、綠兩種顏色之外的其他顏色的種質(zhì)資源，通過常規(guī)的雜交手段難以解決目前彩色棉顏色單調(diào)的問題。人們寄希望利用基因工程手段來改變彩色棉纖維的顏色，完成這項(xiàng)工作的前提是明確彩色棉纖維色素形成的分子機(jī)制。因而，分離、鑒定彩色棉纖維色素物質(zhì)并解析其形成的分子機(jī)制

2、將為利用基因工程手段改良彩色棉纖維色澤品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：⑴通過MALDI-TOF MS、NMR及HPLC等方法，鑒定棕色棉纖維中原花色素的的種類、分子質(zhì)量、聚合度、基本結(jié)構(gòu)單元及其空間連接方式；分析原花色素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵基因GhANR、GhLAR和GhMATE表達(dá)模式，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建GhANR基因的過表達(dá)和干擾載體，分別轉(zhuǎn)化白色棉和棕色棉。⑵用脂溶性和水溶性提取液，提取分離綠色棉纖維色素物質(zhì)。克隆綠

3、色棉纖維中的4CL基因，篩選綠色棉纖維中優(yōu)勢表達(dá)的4CL基因，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建其過表達(dá)和干擾載體，轉(zhuǎn)化白色棉和綠色棉。
　　結(jié)論：①棕色棉纖維中原花色素是由90.1％的原翠雀素和9.9%原花青素組成，其基本結(jié)構(gòu)單元黃烷-3-醇的空間立體結(jié)構(gòu)為2,3-順式構(gòu)型（即表?xiàng)攦翰杷?表兒茶素）；白色棉纖維中原花色素大約是由等比例的的原翠雀素和原花青素（約為1:1.05）組成，其基本結(jié)構(gòu)單元黃烷-3-醇結(jié)的空間立體結(jié)構(gòu)為2,3-順式

4、構(gòu)型（即表?xiàng)攦翰杷?表兒茶素）。另外，白色棉纖維中的原花色素結(jié)構(gòu)中還存在一定比例的棓?；?。在棕色棉纖維發(fā)育過程中原花色素的含量和聚合度急劇增加，30DPA達(dá)到最大，隨后逐漸減少。與白色棉相比，棕色棉纖維中原花青素含量顯著高于白色棉纖維，聚合度也較白色棉大。香草醛-鹽酸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，成熟的棕色棉和白色纖維均檢測不到原花色素，但是，未成熟棕色棉纖維中含有大量的原花色素，而白色棉從發(fā)育15DPA纖維開始原花色素含量明顯減少。Borntrage

5、r's反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，隨著纖維發(fā)育，醌類化合物在棕色棉中含量逐漸增多，而且在成熟纖維中含量仍然很高。相反，未成熟的和成熟的白色棉纖維均沒有顏色變化，表明白色棉纖維中沒有醌類化合物的積累。上述實(shí)驗(yàn)表明，原花色素氧化成的醌類物質(zhì)是棕色棉顏色形成的直接原因，原花色素在棕色棉纖維中的形成是棕色棉纖維顏色形成的根本原因。在棕色棉纖維發(fā)育過程中，GhANR基因的轉(zhuǎn)錄水平很高，而GhLAR的表達(dá)幾乎就檢測不到?；騁hMATE1a和GhMATE1b均具

6、有12個(gè)跨膜域，聚類分析發(fā)現(xiàn)，其與擬南芥TT12、苜蓿MATE1等蛋白聚為一類，暗示棕色棉纖維中GhMATE1a和GhMATE1b可能與無?；揎椀脑ㄉ厍绑w的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。表達(dá)分析還發(fā)現(xiàn)，GhMATE1a和GhMATE1b在棕色棉纖維中的轉(zhuǎn)錄水平比在白色棉纖維高，分別在21DPA和27DPA達(dá)到最大轉(zhuǎn)錄水平?？寺〔?gòu)建了GhANR的過表達(dá)和干擾載體，轉(zhuǎn)化棉花，得到7棵過表達(dá)陽性再生植株T0代，收獲T1種子，待進(jìn)一步驗(yàn)證。②從綠色棉纖維

7、脂溶性提取溶液中分離得到蘋果酸甲酯和蘋果酸二甲脂，沒有發(fā)現(xiàn)有顏色化合物（除我們前期分離得到的咖啡酰基甘油酯類外）；水溶性提取液中分離得到?jīng)]食子酸和鞣花酸（主要是沒食子酸）。由于沒食子酸及其衍生物與葡萄糖或多酚可以通過酯鍵形成水解單寧，呈現(xiàn)淡黃色至淺棕色夜色，推測綠色棉纖維色素可能也與苯丙烷類衍生物代謝途徑有關(guān)。從綠色棉纖維中克隆獲得了三個(gè)4CL基因，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因均具有MotifⅠ-AMP結(jié)合功能域和MotifⅡ保守域；通