彩色棉纖維比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及花色素還原酶GhANR基因的鑒定.pdf

1、1.研究目的
　　彩色棉是一種成熟吐絮時纖維自身帶有天然色彩的棉花。近年來,人們的健康和環(huán)保意識逐漸增強,天然彩色棉制品倍受人們青睞。然而,彩色棉纖維的顏色僅有綠色和棕色兩大色系,顏色單調(diào),遠(yuǎn)不能滿足人們對于絢麗服飾的需求。由于缺乏除棕、綠兩種顏色之外的其他顏色的種質(zhì)資源,通過常規(guī)的雜交手段難以解決目前彩色棉顏色單調(diào)的問題。人們寄希望利用基因工程手段來改變彩色棉纖維的顏色,完成這項工作的前提是明確彩色棉纖維色素形成的分子機制。本研

2、究利用2-DE結(jié)合質(zhì)譜鑒定分析比較了彩色棉及其白色近等基因系棉纖維蛋白質(zhì)組的差異,分離鑒定差異蛋白,為揭示彩色棉色素合成的分子機制及為利用基因工程手段改良彩色棉纖維色澤品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。
　　2.結(jié)果與結(jié)論
　　2.1.利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略分析比較了棕色棉及其白色近等基因系棉纖維蛋白質(zhì)組差異,利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定了3個纖維發(fā)育時期(12,18和24DPA)共計78個差異蛋白點。研究發(fā)現(xiàn)21個差異蛋

3、白點與植物次生代謝途徑相關(guān),其中15個參與類黃酮物質(zhì)的合成,且均在棕色纖維中表現(xiàn)上調(diào);DMACA染色實驗以及7個原花色素合成關(guān)鍵酶基因的qPCR分析表明,類黃酮在棕色棉纖維色素形成過程中起關(guān)鍵作用,推測原花色素與纖維顏色形成有關(guān)。本研究首次從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度明確了類黃酮在棕色棉纖維色素合成過程中的重要作用,也為類黃酮是棕色纖維中的色素物質(zhì)這一假設(shè)提供了直接的證據(jù)。同時發(fā)現(xiàn)了一些在棕色纖維中下調(diào)的蛋白點,包括糖酵解、氧化還原平衡,細(xì)胞骨架

4、和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白,推測棕色纖維中類黃酮化合物的活躍代謝影響了其它代謝途徑的正常運作,一些纖維發(fā)育相關(guān)的蛋白,如ascorbateperoxidase、superoxidedismutase、actin、annexin和heatshockprotein70等表現(xiàn)下調(diào),是棕色棉纖維品質(zhì)差的主要原因。
　　2.2.利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略分析比較了綠色棉及其白色近等基因系棉纖維蛋白質(zhì)組差異,在3個纖維發(fā)育時期(12,15和24DPA)

5、成功鑒定了25個差異蛋白點。這些差異蛋白點包括次生代謝、能量/碳水化合物代謝、細(xì)胞壁合成、蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞骨架、氨基酸代謝、細(xì)胞響應(yīng)和脂代謝等相關(guān)蛋白,其中大部分蛋白點表現(xiàn)為下調(diào)。幾個差異明顯的蛋白點分別為phospholipaseD、phenylcoumaranbenzylicetherreductase和s-adenosylmethioninesynthase,暗示它們在綠色棉色素合成過程中起關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步尋找綠色纖維中色素合

6、成相關(guān)基因,本研究利用雙向電泳技術(shù)研究了21DPA綠色棉纖維蛋白質(zhì)組,從凝膠上挖取220個蛋白點進(jìn)行MALDITOF/TOF分析,成功鑒定出156個蛋白。根據(jù)蛋白的功能將這些蛋白分成12類,主要包括能量/碳水化合物代謝、細(xì)胞壁合成、氧化還原平衡和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白,反映了21DPA綠色棉纖維中的生理活動狀態(tài)。根據(jù)差異蛋白質(zhì)組策略和21DPA蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),在綠色纖維中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的色素合成途徑,類黃酮相關(guān)蛋白點在綠色纖維中無上調(diào)現(xiàn)象,表明綠

7、色纖維中的色素物質(zhì)與棕色纖維不同。
　　2.3.花色素還原酶是合成表兒茶素的關(guān)鍵酶之一,表兒茶素是原花色素的合成單元。利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)了一個在棕色棉纖維中明顯上調(diào)的蛋白點,質(zhì)譜鑒定為花色素還原酶。根據(jù)GenBank中該蛋白的cDNA序列克隆了GhANR基因,該基因包含1008bp核酸序列,編碼336個氨基酸殘基。實時熒光定量PCR分析顯示GhANR在棕色纖維中的表達(dá)量高于白色棉。將GhANR連接至蛋白表達(dá)載體pET28a