2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:
   以xCT缺陷的Sut黑色素細(xì)胞為研究對(duì)象,以野生型Mela黑色素細(xì)胞為對(duì)照,應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究Sut細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化,從蛋白質(zhì)組水平上尋找與xCT缺陷相關(guān)的蛋白質(zhì),為研究xCT缺陷引起的細(xì)胞生長抑制的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)支持。
   研究方法:
   1.Sut和Mela細(xì)胞的培養(yǎng)、收集與總蛋白質(zhì)的制備
   Sut和Mela細(xì)胞用含10%胎牛血清,100units/ml雙抗的DM

2、EM/F12培養(yǎng)液,于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,細(xì)胞中加入適量裂解液裂解后以1,7000 r/min高速離心45min,取上清液即為細(xì)胞總蛋白。
   2.Sut和Mela細(xì)胞總蛋白質(zhì)的二維凝膠電泳及差異蛋白質(zhì)的串聯(lián)質(zhì)譜分析以Bradford方法測(cè)定Sut和Mela細(xì)胞的總蛋白濃度,對(duì)兩組樣品分別進(jìn)行二維凝膠電泳,應(yīng)用PDQuest軟件分析兩組樣品的二維凝膠電泳圖譜,挑選出Sut細(xì)胞中表達(dá)量明顯變化

3、的蛋白質(zhì)點(diǎn),對(duì)這些蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。
   3.數(shù)據(jù)庫查詢鑒定差異蛋白質(zhì)
   將串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)輸入Mascot軟件,在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中搜索,鑒定出差異蛋白質(zhì)。
   4.RT-PCR方法檢測(cè)Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA水平
   提取Sut和Mela細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得細(xì)胞cDNA,通過PCR擴(kuò)增Calmodul

4、in、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的基因,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠掃描,保存圖像,通過繪制柱狀圖對(duì)比Sut細(xì)胞與Mela細(xì)胞mRNA表達(dá)量差異水平。
   研究結(jié)果:
   1.Sut細(xì)胞表達(dá)差異蛋白質(zhì)的鑒定
   比較Sut和Mela細(xì)胞總蛋白質(zhì)的二維凝膠電泳圖譜,發(fā)現(xiàn)Sut細(xì)胞有20個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生明顯變化,其中10個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯上調(diào),另外10個(gè)明顯下調(diào)。對(duì)這20個(gè)蛋白

5、質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,將質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中搜索查詢,鑒定出這些蛋白質(zhì)。表達(dá)量上調(diào)的10個(gè)蛋白質(zhì)分別為:波形纖維蛋白(Vimentin),肌動(dòng)蛋白alpha-1b(Tubulin alpha-1b),肌動(dòng)蛋白beta-5(Tubulin beta-5),鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白A3(Annexin A3),鈣調(diào)素(Calmodulin),鈣結(jié)合蛋白S100-A4(protein S100-A4),分子量為11kDa

6、的未知蛋白質(zhì),鈣結(jié)合蛋白S100-A6(protein S100-A6),核苷二磷酸激酶B(Nucleosidediphosphate kinase B,NME2),甲酰谷胱甘肽(S-formylglutathione);表達(dá)量下調(diào)的10個(gè)蛋白質(zhì)分別為:鈣腔蛋白(Calumenin),N-Myc下游調(diào)控基因1(N-Mycdownstream regulated gene1,NDRG1)蛋白,鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Ornithineamino

7、transferase),二硫鍵異構(gòu)酶A3(protein disulfide isomerase A3,PDIA3),二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2(Dihydropyrimidinase-related protein2,DPYSL2),ATP合成酶ATP5A1(ATP5A1),H2B組蛋白(Histone H2B type1-K,HISTLH2BK),分子量為14kDa的未知蛋白質(zhì),基因序列號(hào)為OTTMUSG00000007855的未知蛋白

8、質(zhì)和分子量為47kDa的未知蛋白質(zhì)。
   2.RT-PCR方法檢測(cè)Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA水平
   通過RT-PCR方法驗(yàn)證Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,和Mela細(xì)胞相比,Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA表達(dá)水平在Sut細(xì)胞中

9、明顯上調(diào)。
   研究結(jié)論:
   1.與Mela細(xì)胞相比,Sut細(xì)胞中有20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量存在明顯變化,其中10個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào),10個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)。有3個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(Vimentin,Tubulin alpha-1b,Tubulin beta-5),3個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)為鈣結(jié)合蛋白(Calmodulin,protein S100A-4,protein S100A-6),2個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)為蛋白酶(S

10、-formylglutathione,Annexin A3);5個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)為蛋白酶(proteinNDRG1,PDIA3,ATP5A1,Ornithine aminotransferase aminotransfemse,NME2),2個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)(DPYSL2,HISTLH2BK3)。
   2.鑒定出的xCT缺陷相關(guān)蛋白質(zhì)在細(xì)胞的自體吞噬、胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸、MAP激酶信號(hào)通路,DNA復(fù)制等過程中起到重要作

11、用,推測(cè)自體吞噬、MAP激酶信號(hào)通路可能在xCT缺陷引起的細(xì)胞生長抑制中起關(guān)鍵作用。自體吞噬、MAP激酶信號(hào)通路在Sut細(xì)胞生長抑制中的作用還有待于進(jìn)一步研究。
   3.通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),和Mela細(xì)胞相比,Sut細(xì)胞中Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào),證明xCT缺陷的Sut細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控Calmodulin、Annexin A3、Vimen

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