Claudin-3和claudin-4在子宮內(nèi)膜惡性轉(zhuǎn)化中的意義.pdf

1、第一部分claudin-3和claudin-4在正常、增生和惡性子宮內(nèi)膜組織中的表達 目的：檢測claudin-3和claudin-4在正常子宮內(nèi)膜、增生性子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達，探討claudin-3和claudin-4在正常子宮內(nèi)膜惡性轉(zhuǎn)化中的作用，分析claudin-3和claudin-4的表達與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的關(guān)系。 方法：研究對象為25例正常增殖期子宮內(nèi)膜、25例正常分泌期子宮內(nèi)膜、2

2、0例單純性增生內(nèi)膜、12例復雜性增生內(nèi)膜、15例不典型增生內(nèi)膜和30例子宮內(nèi)膜樣腺癌組織。透射電鏡觀察正常分泌期子宮內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜和內(nèi)膜癌組織中緊密連接形態(tài)學的變化。分別用免疫組化和western blot法檢測claudin-3和claudin-4的蛋白表達，用real-time PCR法檢測claudin-3和claudin-4的mRNA表達。 結(jié)果：(1)透射電鏡下見子宮內(nèi)膜樣腺癌細胞的緊密連接結(jié)構(gòu)崩解，不典型增生內(nèi)

3、膜相鄰腺上皮細胞的緊密連接結(jié)構(gòu)似正常分泌期子宮內(nèi)膜，未見明顯的結(jié)構(gòu)變化。 (2)claudin-3和claudin-4的陽性免疫組化染色主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞膜。從正常增殖期內(nèi)膜、正常分泌期內(nèi)膜、單純性增生內(nèi)膜、復雜性增生內(nèi)膜、到不典型增生內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣腺癌組織，期性染色的比例逐漸增高。 (3)western blot分析在正常增殖期內(nèi)膜、正常分泌期內(nèi)膜、單純增生性內(nèi)膜、復雜增生性內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣

4、腺癌組織中，claudin-3的蛋白相對表達率分別為(24.8±11.2)﹪、(30.1±17.7)﹪、(44.3±21.4)﹪、(48.2±20.9)﹪、(97.5±31.4)﹪和(147.0±37.7)﹪；claudin-4的蛋白相對表達率分別為(26.8±14.0)﹪、(32.4±13.9)﹪、(48.6±23.5)﹪、(60.7±27.3)﹪、(128.3±35.8)﹪和(210.1±41.2)﹪。在相同病理類型的內(nèi)膜組織中cl

5、audin-3和claudin-4比較，claudin-4的表達水平略高于claudin-3，但統(tǒng)計學無顯著性差異。claudin-3和claudin-4在不典型增生內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的蛋白表達顯著高于正常增殖期內(nèi)膜、正常分泌期內(nèi)膜、單純增生性內(nèi)膜和復雜增生性內(nèi)膜。后四者之間claudin-3和claudin-4的表達無顯著差異。claudin-3和claudin-4在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達最強，顯著高于不典型增生內(nèi)膜。

6、 (4)在癌灶局限于子宮內(nèi)膜、肌層浸潤不超過l/2和肌層浸潤超過1/2的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中claudin-3的蛋白表達分別為(97.1±14.5)﹪、(109-3±35.7)﹪、(170.4±20.91﹪；claudin.4的蛋白表達分別為(132.6±10.3)﹪、(174.7±41.8)﹪、(229.1±39.2、﹪。claudin-3和claudin.4的表達與肌層浸潤程度呈正相關(guān)。子宮內(nèi)膜樣腺癌組織qUclaudin-3和

7、claudin-4的表達與內(nèi)膜癌的手術(shù)病理分期和組織分級無明顯相關(guān)性。 (5)在正常增殖期內(nèi)膜、正常分泌期內(nèi)膜、單純增生性內(nèi)膜、復雜增生性內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，claudin-3 mRNA的相對定量分別為13.7±2.4、16.2±5.6、25.9±10.3、29.2±12.3、73.4±23.5和104.6±34.1：claudin-4 mRNA的相對定量分別為20.0±5.8、25.3±7.1、43.2

8、±16.5、46.8±20.4、123.7~34.0和220.5±56.2。claudin-3和claudin-4在不典型增生內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中mRNA的表達顯著高于正常內(nèi)膜、單純增生性內(nèi)膜和復雜增生性內(nèi)膜。子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中claudin-3和claudin-4mRNA的表達顯著高于不典型增生內(nèi)膜。 結(jié)論：緊密連接形態(tài)學的變化可能滯后于claudins表達的增加。claudin-3和claudin-4在正常子宮內(nèi)膜、

9、單純增生性內(nèi)膜和復雜增生性內(nèi)膜中的表達水平較低，在不典型增生內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達顯著增強。提示claudin-3和claudin-4可能在子宮內(nèi)膜的惡性轉(zhuǎn)化中起一定作用。 第二部分孕激素對子宮內(nèi)膜癌細胞系claudin-3和claudin-4表達的調(diào)節(jié) 目的：檢測子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa中claudin-3和claudin-4的表達狀態(tài)，及孕激素處理前后claudin-3和claudin-4表達的變化

10、。探討claudin-3和claudin-4是否與孕激素治療子宮內(nèi)膜癌的作用機制有關(guān)。 方法：用濃度分別為2.5mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg／l、20mg/l的甲地孕酮刺激培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa 24、48、72d、時，MTT法檢測Ishikawa細胞生長的抑制率，選擇最佳半抑制濃度。透射電鏡觀察孕激素處理前后細胞的形態(tài)變化；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率；real-time PCR測定孕激素處理前后Ish

11、ikawa細胞中claudin-3和claudin-4 mRNA的表達，western blot檢測其蛋白水平的表達。細胞免疫熒光染色觀察孕激素處理前后claudin蛋白的熒光分布。無藥物處理組做對照。 結(jié)果：甲地孕酮能抑制Ishikawa細胞的生長，濃度為15mg/l作N72d,時時Ishikawa細胞生長抑制率達50﹪。甲地孕酮處理后，透射電鏡見細胞凋亡；孕激素處理前細胞凋亡率為(0.064±0.02)﹪，孕激素處理后細胞凋

12、亡率升至(3.74±0.69)﹪。Real-time PCR和westem blot證實Ishikawa細胞表達claudin-4，未檢測到claudin-3的表達。孕激素處理前后Ishikawa細胞claudin-4 mRNA的相對定量分別為 62.3±18.5和57.4±15.9；蛋白相對表達率分別為(91.7±21.5)﹪和(86.44±17.6)﹪。孕激素處理前后claudin-4的mRNA和蛋白表達水平均無顯著變化。細胞熒光染

13、色顯示細胞膜分布的claudin-4在孕激素干預后由細胞膜進入細胞漿和細胞核。 結(jié)論：孕激素可以抑制IshikaWa細胞的生長，其對細胞生長的抑制作用可能與細胞凋亡有關(guān)。Ishikawa細胞存在claudin-4的表達，無claudin-3的表達。細胞膜表達的claudin-4整合入細胞內(nèi)部可能與孕激素抑制Ishikawa細胞生長的信號轉(zhuǎn)導有關(guān)。 第三部分claudin-3和claudin-4在異位子宮內(nèi)膜組織中的表達

14、 目的：檢測claudin-3和claudin-4在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的表達，評價claudin-3和claudin-4在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中的作用。 方法：選擇35例子宮內(nèi)膜異位癥患者的卵巢異位內(nèi)膜、27例異位癥患者的在位子宮內(nèi)膜和35例正常對照子宮內(nèi)膜。透射電鏡觀察正常分泌期子宮內(nèi)膜、異位癥患者的在位分泌期內(nèi)膜和卵巢異位內(nèi)膜組織中緊密連接形態(tài)學的變化。免疫組化和western b

15、lot法檢測claudin-3和claudin-4的蛋白質(zhì)表達，real-time PCR檢測claudin-3和claudin-4 mRNA的表達。 結(jié)果：(1)透射電鏡下卵巢異位內(nèi)膜組織中緊密連接結(jié)構(gòu)消失，膠原組織豐富。異位癥患者的在位內(nèi)膜中緊密連接結(jié)構(gòu)似正常分泌期子宮內(nèi)膜，未見明顯的結(jié)構(gòu)變化。(2)claudin-3和claudin-4的陽性免疫組化染色主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞膜。在正常子宮內(nèi)膜、異位癥在位內(nèi)膜和異位內(nèi)

16、膜中claudin-3的陽性表達率分別為45.7﹪、44.4﹪、17.1﹪； claudin-4的陽性表達率分別為51.5﹪、48.1﹪、20﹪。claudin-3和claudin-4在卵巢異位內(nèi)膜組織中的表達水平顯著低于異位癥患者的在位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜。(3)western blot分析claudin-3在正常子宮內(nèi)膜，異位癥患者的在位內(nèi)膜和卵巢異位內(nèi)膜組織中的蛋白相對表達率分別為(85.5±16.9)﹪、(79.9±16.4)﹪、

17、(20.7±11.2)﹪；claudin-4的表達分別為(89.4±24.1)﹪、(83.5±21.8)﹪、(26.8±13.6)﹪。Claudin-3在正常子宮內(nèi)膜，異位癥患者的在位內(nèi)膜和卵巢異位內(nèi)膜組織中mRNA的相對定量分別為12.9±6.4、12.4±6.3、2.0±1.4：claudin-4的mRNA相對定量分別為14.5±6.8、13.8±9.5、2.6±2.5。方差分析卵巢異位內(nèi)膜組織中claudin-3和claudin-