Harpins蛋白誘導(dǎo)植物防衛(wèi)和生長(zhǎng)及四種激素信號(hào)的交叉調(diào)控作用.pdf

1、植物防衛(wèi)反應(yīng)的激活是通過(guò)植物識(shí)別激發(fā)子開(kāi)始的。革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)激發(fā)子harpins可誘導(dǎo)植物多種反應(yīng),如抗病,抗蟲,促生長(zhǎng)和抗旱等。作為一種多功能激發(fā)子,它非常有利于研究植物在生長(zhǎng)發(fā)育,抗病防衛(wèi),抗蟲和抗逆等過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。于是,harpins如何被植物識(shí)別,如何引發(fā)各種效應(yīng),并且這些反應(yīng)中有哪些信號(hào)通路參與,它們相互之間有沒(méi)有交叉對(duì)話,如何交叉對(duì)話、以及harpins如何實(shí)現(xiàn)這些功能等多個(gè)問(wèn)題成為了研究的重

2、點(diǎn)。 1.不同HpaGXooc功能片段的分離鑒定及對(duì)植物的誘導(dǎo)抗病和促生長(zhǎng)作用 Harpins是由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)激發(fā)子,他們的共同特點(diǎn)是：富含甘氨酸、熱穩(wěn)定、對(duì)蛋白酶敏感,注射到產(chǎn)生菌的非寄主植物葉片細(xì)胞間隙后,可以誘導(dǎo)過(guò)敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death,HCD),誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)。 水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae

3、 pv.oryzicola)HpaGXooc作為Harpin蛋白家族中的一員,包含兩個(gè)富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域(glycine-rich motif,GRM),一個(gè)半胱氨酸殘基(cysteine)。GRM是Harpin類蛋白質(zhì)共有的特征,而半胱氨酸則是其他Harpin類蛋白質(zhì)所沒(méi)有的。本研究根據(jù)HpaGXooc不同功能域和區(qū)段,基于PCR的體外誘變技術(shù)產(chǎn)生九個(gè)HpaGXooc的蛋白質(zhì)功能片段,分別為HpaG1-105、HpaG1-94,Hpa

4、G1-61、HpaG1-47、HpaGT-61、HpaG62-137、HpaG10-42、HpaG95-137,HpaG84-94,右下角的數(shù)字分別代表了蛋白質(zhì)所包括的HpaGXooc相應(yīng)的氨基酸區(qū)域。將這九個(gè)片段體外表達(dá),產(chǎn)生的蛋白質(zhì)施用于煙草(Nicotiana tabaccum)和水稻(Oryza sativa)能產(chǎn)生不同的效應(yīng)。 同HpaGXooc全長(zhǎng)蛋白相比較,HpaG62-137能在煙草上誘導(dǎo)更強(qiáng)的HCD,而HpaG

5、10-42不表現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡,但都能在水稻上能激發(fā)更強(qiáng)的防衛(wèi)反應(yīng)和促進(jìn)植株更快的生長(zhǎng)在檢測(cè)的9個(gè)片段及全長(zhǎng)蛋白質(zhì)中,對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzae pv。oryzae)的抗性誘導(dǎo)效應(yīng)中,HpaG10-42誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng),HpaG1-6Z和HpaG7-61次之,HpaG62-137的誘導(dǎo)抗病性效應(yīng)表現(xiàn)為最低；而對(duì)稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的誘導(dǎo)抗性效應(yīng)中,HpaG62-137處理的葉片上僅能看到

6、侵染點(diǎn),沒(méi)有明顯的壞死斑；而HpaG10-42處理的葉片上甚至連壞死斑都無(wú)法看見(jiàn)。 在蛋白粗提液實(shí)驗(yàn)中HpaG1-94、HpaG10-42、HpaG62-137和ΔGRM對(duì)植物的作用明顯強(qiáng)于HpaGXooc,因此我們將這幾種蛋白質(zhì)進(jìn)行鎳柱純化,并進(jìn)一步檢測(cè)、驗(yàn)證他們的生物活性以確證上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從結(jié)果可以看出不管是粗蛋白提取液還是純化蛋白質(zhì)均表現(xiàn)相同的效應(yīng)。 總之,本研究結(jié)果闡釋了一個(gè)HpaGXooc的特異性片段Hpa

7、G10-42能促進(jìn)水稻生長(zhǎng)和誘導(dǎo)抗病性,具有潛在的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 2.HrpN_(Ea)誘導(dǎo)植物生長(zhǎng)和膨脹素基因表達(dá)及乙烯與赤霉素的調(diào)控作用 膨脹素(Expansin)是植物細(xì)胞生長(zhǎng)期間釋放的一種能使細(xì)胞壁松弛的蛋白質(zhì),是細(xì)胞壁的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有重要作用。本文報(bào)道了HrpN_(Ea)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)expansin基因表達(dá)所啟動(dòng)的不同信號(hào)通路。 本文檢測(cè)了HrpN_(Ea)處理四種不同植物后對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)基

8、因的誘導(dǎo)表達(dá)。HrpN_(Ea)處理后擬南芥AtEXP7在葉片和莖中表達(dá)不明顯,而在根中表達(dá)量較高；LeEXP2和LeEXP5在莖中表達(dá)而在葉片和根中不表達(dá)；另外8個(gè)EXPs,包括AtEXP10和AtEXP2在葉片中表達(dá)量高,而在根和莖中表達(dá)量較低。在不同的器官、不同的處理模式及誘導(dǎo)時(shí)間的不同,基因表達(dá)水平也不相同。 為了闡釋Hrp誘導(dǎo)E印s基因表達(dá)和促生長(zhǎng)作用同乙烯信號(hào)通路的相關(guān)性,我們測(cè)定了HrpN_(Ea)處理后乙烯信號(hào)通

9、路中關(guān)鍵基因的表達(dá)情況及同EXPs表達(dá)的關(guān)系。 本文比較了HrpNEa和GA3對(duì)水稻OsEXPs基因的影響。水稻中EXPs基因均能被HrpNEa和GA3誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)。水稻中HrpNEa導(dǎo)OsEXP2、OsEXP4和OsEXP16表達(dá)增強(qiáng),作用類似于GA3。但HrpNEa的作用明顯滯后于GA3,并且誘導(dǎo)效應(yīng)低于GA3。尤其是OsEXP2和OsEXPl6,在GA3處理6小時(shí)后開(kāi)始持續(xù)增強(qiáng)表達(dá),而HrpNEa處理12小時(shí)后表達(dá)水平才逐

10、漸增強(qiáng)。OsEXP4基因在處理12小時(shí)后表達(dá)開(kāi)始明顯增強(qiáng),然后一直保持在正常表達(dá)水平。 本研究結(jié)果說(shuō)明HrpNEa促生長(zhǎng)和誘導(dǎo)EXPs基因表達(dá)需要乙烯和赤霉素信號(hào)通路。 3.煙草誘導(dǎo)防衛(wèi)與生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)基因CES1的克隆和功能初步分析 本實(shí)驗(yàn)室以前使用病毒TMV N14和CMV SV52分別誘導(dǎo)處理NC89后,通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系繁殖得到兩個(gè)突變體ces1-1、ces2-1,三者在抗病性和長(zhǎng)勢(shì)上存在明顯差異,在幼苗期c

11、es2-1的長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng),ces1-1的長(zhǎng)勢(shì)最弱；5-6葉期之后NC89的長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng),而ces2-1的長(zhǎng)勢(shì)減弱,ces1-1的長(zhǎng)勢(shì)最弱。5-6葉期接種煙草赤星病菌(Alternaria alternata)發(fā)現(xiàn),ces1-1,ces2-1的抗病性較NC89明顯強(qiáng),且ces2-1較ces1-1強(qiáng)。 本研究中利用差顯片段設(shè)計(jì)特異性引物,RACE法克隆到全長(zhǎng)基因,CES1基因ORF長(zhǎng)372 bp堿基,翻譯出的蛋白質(zhì)一級(jí)機(jī)構(gòu)包括124個(gè)氨基酸

12、,命名為CES1(constitutive expresser of systemic acquired resistancel)。通過(guò)功能分析發(fā)現(xiàn),此蛋白質(zhì)在53-69 bp之間有一個(gè)富含脯氨酸/蘇氨酸區(qū)域(Pro/Thr-rich domain)、含有一個(gè)氨基葡聚糖結(jié)合位點(diǎn)、兩個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、兩個(gè)酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)以及三個(gè)N端?；稽c(diǎn)。在線預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)有2個(gè)α-螺旋、3個(gè)β-片、6個(gè)翻轉(zhuǎn)。 4.乙烯與脫

13、落酸信號(hào)共同調(diào)控HrpNEa誘導(dǎo)的韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)與昆蟲驅(qū)避 本章初步研究了擬南芥ABA和ET信號(hào)傳導(dǎo)通路協(xié)同作用參與了HrpEa介導(dǎo)的PRD反應(yīng)及抗蟲驅(qū)避效應(yīng),并且初步篩選了13個(gè)受HrpNEa上調(diào)并且參與調(diào)控ABA和ET信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。原位雜交及化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HrpNEa處理后可以增加在韌皮部產(chǎn)生韌皮部相關(guān)蛋白的表達(dá)及沉積胼胝質(zhì),兩者共同構(gòu)成了PRD反應(yīng),并且有利于驅(qū)避蚜蟲、減少蚜蟲韌皮部取食活動(dòng)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明H

14、rpNEa誘導(dǎo)的蚜蟲驅(qū)避效應(yīng)需要EIN2和ABI2因子的協(xié)同作用,同時(shí)蚜蟲的取食活動(dòng)同驅(qū)避效應(yīng)有關(guān)。 對(duì)擬南芥生態(tài)型Col-0和Ler-0在HrpNEa處理后蚜蟲趨避效應(yīng)以及蚜蟲刺吸電子信號(hào)分析,結(jié)果表明蚜蟲更喜好取食Col-0型植株；同時(shí)對(duì)照處理中,蚜蟲驅(qū)避效應(yīng)主要發(fā)生在20-40分鐘和3-12小時(shí)兩個(gè)階段；而在HrpNEa處理中,蚜蟲驅(qū)避主要集中在1-12小時(shí)。 遺傳學(xué)和化學(xué)藥物抑制雙重實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,ET和ABA信號(hào)

15、通路交叉調(diào)控HrpNEa誘導(dǎo)的抑制蚜蟲繁殖力的效應(yīng),植株ET和ABA的產(chǎn)生及接受能力對(duì)于蚜蟲趨避是很關(guān)鍵的。化學(xué)抑制ABA不敏感突變體abi2-1中ET的接受以及化學(xué)抑制乙烯不敏感突變體ein2-1中ABA生物合成均抑制了HrpNEa的誘導(dǎo)效應(yīng)。 5.總結(jié) 通過(guò)以上研究結(jié)果,本文對(duì)harpins誘導(dǎo)防衛(wèi)和調(diào)控生長(zhǎng)的作用機(jī)理有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。第一,本研究根據(jù)HpaGXooc不同功能域和區(qū)段,分離、鑒定了九個(gè)HpaGXoo

16、c的蛋白質(zhì)功能片段,并對(duì)不同的功能片段進(jìn)行了生物活性測(cè)定,結(jié)果顯示不同的功能片段在植物上的效應(yīng)也不相同,其中功能片段HpaG62-137能在煙草上誘導(dǎo)更強(qiáng)的HCD,而HpaG10-42不表現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡,但他們都能在水稻上激發(fā)更強(qiáng)的防衛(wèi)反應(yīng)和促進(jìn)植株更快的生長(zhǎng)。第二,HrpNEa促進(jìn)植物生長(zhǎng)過(guò)程中,誘導(dǎo)了細(xì)胞壁松弛蛋白基因EXPs基因的表達(dá),并且兩者需要通過(guò)乙烯和赤霉素信號(hào)通路。在番茄、煙草和擬南芥中,抑制赤霉素合成和乙烯接受同樣也抑

17、制了HrpNEa誘導(dǎo)EXP基因表達(dá)和促生長(zhǎng)效應(yīng)。第三,本論文初步研究了擬南芥脫落酸(ABA)和乙烯(ET)信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了HrpNEa介導(dǎo)的PRD反應(yīng)及抗蟲趨避效應(yīng),結(jié)果證明HrpNEa誘導(dǎo)的蚜蟲趨避效應(yīng)需要EIN2(ETHYLENE INSENSITIVE 2)和ABI2(ABA INSENSITTVE 2)因子的協(xié)同作用,原位雜交及化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HrpNEa處理后可以增加在韌皮部產(chǎn)生韌皮部相關(guān)蛋白的表達(dá)及沉積胼胝質(zhì),并且初步