反義肽核酸封閉線粒體DNA轉(zhuǎn)錄啟動子對肺癌細(xì)胞-肺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的初步研究.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。由于不良生活習(xí)慣和環(huán)境污染等因素,其發(fā)病率不斷上升(近30年來我國肺癌發(fā)病率上升了465％),已成為我國發(fā)病率、死亡率第一的惡性腫瘤[1]。然而,目前臨床肺癌綜合治療措施的效果尚不理想,患者5年生存率＜15％[2]。因此,尋找新的治療靶點(diǎn)和新的治療方法,顯得尤為迫切。
　　線粒體是真核細(xì)胞最重要的供能細(xì)胞器,參與能量代謝、保持離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖和凋亡等眾多生理/病理過程。線粒體DNA(Mitocho

2、ndrial DNA,mtDNA)作為真核細(xì)胞唯一的核外遺傳物質(zhì),編碼13個與能量代謝相關(guān)的多肽,其損傷和轉(zhuǎn)錄障礙將導(dǎo)致所編碼的多肽表達(dá)減少,電子傳遞鏈效率下降,滲透性轉(zhuǎn)換孔開放,細(xì)胞凋亡[3];越來越多的證據(jù)表明,線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變,不僅會干擾腫瘤細(xì)胞的生長、能量代謝和增殖等過程,最終還會觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死[4]。因此,以肺癌細(xì)胞線粒體作為治療靶點(diǎn)是一個值得探索的方向。如果能應(yīng)用反義技術(shù)和反義物質(zhì),特異性地封閉肺癌細(xì)胞mtDN

3、A的轉(zhuǎn)錄啟動子,則可能導(dǎo)致線粒體蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)障礙,從而引起線粒體電子傳遞鏈障礙,繼而影響肺癌細(xì)胞的生存和正常功能的維持。
　　本研究1.觀察比較了多種肺癌細(xì)胞和正常人支氣管上皮細(xì)胞線粒體膜電位,證實了肺癌細(xì)胞的線粒體膜電位是高于正常人支氣管上皮細(xì)胞的線粒體膜電位。2.構(gòu)建了反義肽核酸(Anti-sense peptide nucleic acid,asPNA)-三苯磷復(fù)合物,利用電子移位親脂性陽離子類物質(zhì)(delocaliz

4、ed lipophilic cations,DLCs)-三苯磷,能夠在高線粒體膜電位的推動下,選擇性地積聚于肺癌細(xì)胞線粒體內(nèi)的特性[5],運(yùn)載針對mtDNA重鏈轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域的asPNA,阻抑肺癌mtDNA編碼基因的轉(zhuǎn)錄,觀察其對肺癌細(xì)胞能量產(chǎn)生、凋亡/壞死等生物學(xué)特性的影響。
　　研究過程中,我們發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞群體內(nèi)部,線粒體膜電位也存在明顯的異質(zhì)性,而這種異質(zhì)性同肺癌細(xì)胞分化程度之間存在聯(lián)系,即肺癌干細(xì)胞亞群的線粒體膜電位高于

5、分化的肺癌細(xì)胞。3.我們在分離鑒定肺癌干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,還進(jìn)一步觀察了asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染后,對肺癌干細(xì)胞亞群生物學(xué)性質(zhì)的影響。
　　方法:
　　1.分別采用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測比較不同肺癌細(xì)胞系(SPC-A1、H446)與正常人支氣管上皮細(xì)胞(Human Bronchus Epithelium,HBE)的線粒體膜電位。
　　2.設(shè)計并用固相合成法合成asPNA-三苯磷復(fù)合物;用高壓液相色譜法

6、和質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定;激光共聚焦顯微鏡觀察復(fù)合物轉(zhuǎn)染肺癌SPC-A1細(xì)胞;RT-PCR法檢測asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染后SPC-A1細(xì)胞mtDNA重鏈編碼基因ATP合酶8(ATPase8)表達(dá)情況;自發(fā)光熒光儀檢測asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染后SPC-A1細(xì)胞的ATP合成的變化;用PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)觀察asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染后SPC-A1細(xì)胞后的細(xì)胞周期;Annexin-v-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染后SPC

7、-A1細(xì)胞凋亡/壞死。
　　3.觀察不同腫瘤細(xì)胞系(A549、SPC-A1、H446、SGC、Hela)的克隆異質(zhì)性;并用激光共聚焦顯微鏡檢測不同克隆中細(xì)胞的線粒體膜電位;了解腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的異質(zhì)性;免疫熒光法檢測SPC-A1細(xì)胞不同克隆中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況;激光共聚焦顯微鏡觀察不同克隆中SP細(xì)胞的分布情況及不同克隆中細(xì)胞線粒體的分布情況。
　　4.根據(jù)肺癌細(xì)胞緊密型克隆具有干細(xì)胞特性,采用改進(jìn)的無血清干細(xì)

8、胞培養(yǎng)法,于SPC-A1中培養(yǎng)肺癌干細(xì)胞球;獲取肺癌干細(xì)胞球后,免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測其CD133表達(dá);利用裸鼠成瘤實驗檢測肺癌干細(xì)胞的致瘤能力;流式細(xì)胞儀檢測比較肺癌干細(xì)胞球和分化肺癌SPC-A1細(xì)胞的線粒體膜電位。
　　5.激光共聚焦顯微鏡觀察asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染肺癌干細(xì)胞的效果,利用裸鼠成瘤實驗檢測轉(zhuǎn)染asPNA-三苯磷復(fù)合物肺癌干細(xì)胞的成瘤能力。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析:數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較

9、采用t檢驗,以SPSS12.0軟件進(jìn)行分析。P＜0.05為差異顯著。
　　結(jié)果:
　　1.肺癌細(xì)胞的線粒體膜電位要高于正常人支氣管上皮細(xì)胞。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:熒光強(qiáng)度代表線粒體膜電位,SPC-A1(266.924.4,P＜0.01)和H446細(xì)胞(194.4±17.0,P＜0.01)高于HBE(138.1±19.7)。
　　激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果:熒光強(qiáng)度代表線粒體膜電位,SPC-A1(1.90

10、±0.06,P＜0.01)和H446細(xì)胞(1.91+0.03,P＜0.01)高于HBE(1.72±0.02)。
　　2.asPNA-三苯磷復(fù)合物符合要求。
　　asPNA-三苯磷復(fù)合物高壓液相色譜鑒定結(jié)果顯示,在22.1min處可見一單峰,未見明顯的雜質(zhì)峰,與標(biāo)準(zhǔn)品一致;添加電荷后,質(zhì)譜分析:復(fù)合物分子量為3982.2,而設(shè)計asPNA-三苯磷復(fù)合物,其分子量為3979.9,表明:asPNA-三苯磷復(fù)合物符合設(shè)計要求。

11、
　　3.asPNA-三苯磷復(fù)合物進(jìn)入SPC-A1細(xì)胞線粒體并產(chǎn)生預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)。
　　激光共聚焦顯微鏡觀察顯示asPNA-三苯磷分布于細(xì)胞質(zhì)中,形態(tài)和空間分布同線粒體基本一致,表明asPNA-三苯磷復(fù)合物能夠進(jìn)入肺癌SPC-A1細(xì)胞線粒體內(nèi)。
　　RT-PCR結(jié)果顯示asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染后SPC-A1細(xì)胞mtDNA重鏈編碼基因ATPase8轉(zhuǎn)錄水平下降;流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染組可

12、見明顯的亞二倍體峰,凋亡檢測顯示轉(zhuǎn)染后SPC-A1細(xì)胞的凋亡率也增加(轉(zhuǎn)染:11.83％±0.66％,未轉(zhuǎn)染:2.56％±0.71％),提示,部分細(xì)胞發(fā)生了凋亡/壞死;對轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組ATP的檢測發(fā)現(xiàn)asPNA-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染肺癌SPC-A1細(xì)胞能夠減低ATP的合成(轉(zhuǎn)染:1.2049±0.1122 nmol/mg蛋白,未轉(zhuǎn)染:2.1983±0.1570 nmol/mg蛋白,P＜0.01)。
　　4.腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位存在

13、異質(zhì)性,且與細(xì)胞分化狀態(tài)相關(guān)。
　　激光共聚焦顯微鏡對腫瘤細(xì)胞系不同克隆細(xì)胞線粒體膜電位檢測結(jié)果:緊密克隆中細(xì)胞線粒體膜電位要高于松散型克隆(A549緊密型:854.5±71.96,松散型:618.9±62.2,P＜0.01;SPC-A1緊密型:2029.8±45.9,松散型:1016.6±104.5,P＜0.01:H446緊密型:1175.6±115.3,松散型:848.2±93.8,P＜0.01;SGC緊密型:1498.

14、9±169.2,松散型:912.3±67.1,P＜0.01;Hela緊密型:835.9±98.6,松散型:531.2±44.8,P＜0.01)。
　　肺癌緊密型克隆的細(xì)胞具有能夠表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物、細(xì)胞的線粒體分布更靠近細(xì)胞核等干細(xì)胞特性。
　　5.獲得肺癌干細(xì)胞球,并初步鑒定。
　　利用改進(jìn)的無血清培養(yǎng)法,成功獲得呈球狀生長的肺癌干細(xì)胞球,所培養(yǎng)的肺癌干細(xì)胞球表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133,具有較強(qiáng)的成瘤能力。

15、r>　　6.肺癌干細(xì)胞球線粒體膜電位高于分化的肺癌SPC-A1細(xì)胞。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:熒光強(qiáng)度代表線粒體膜電位,肺癌干細(xì)胞(84.45±12.54)高于SPC.A1(53.53±3.35,P＜0.01)。
　　7.asPNA-三苯磷能夠順利進(jìn)入肺癌干細(xì)胞內(nèi),并影響其成瘤能力。
　　激光共聚焦觀察顯示asPNA-三苯磷分布于細(xì)胞質(zhì)中,形態(tài)和空間分布同線粒體基本一致,熒光物質(zhì)靠近細(xì)胞核周分布相對較密集,符合干

16、細(xì)胞線粒體分布規(guī)律,提示asPNA-三苯磷復(fù)合物能夠順利的轉(zhuǎn)染肺癌干細(xì)胞線粒體內(nèi)。
　　結(jié)論:
　　1.肺癌細(xì)胞的線粒體膜電位高于正常人支氣管上皮細(xì)胞。
　　2.asPNA-三苯磷復(fù)合物能夠在高線粒體膜電位的推動下,積聚于肺癌細(xì)胞內(nèi),并阻抑其線粒體DNA編碼基因的表達(dá),干擾能量代謝,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　3.肺癌細(xì)胞群體內(nèi),線粒體膜電位存在異質(zhì)性,并同細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)。
　　4.asPNA-三苯