完全甜柿及部分雄性種質(zhì)間的親緣關(guān)系研究.pdf

1、中國柿在長期栽培過程中，由于遺傳變異和自然、人工選擇的作用，分化出了許多寶貴的甜柿資源。本研究對部分柿屬雄性種質(zhì)及甜柿種質(zhì)采用RAPD、ISSR等分子標(biāo)記分析，結(jié)合對新發(fā)現(xiàn)原產(chǎn)中國大別山區(qū)雄性種質(zhì)花粉基礎(chǔ)生物學(xué)研究，建立和優(yōu)化柿屬植物ITS-PCR及AFLP技術(shù)體系，對部分柿屬雄性種質(zhì)間親緣關(guān)系、系統(tǒng)演化及遺傳多樣性進行了分析比較，探討柿屬雄性種質(zhì)在中國原產(chǎn)甜柿起源演化中可能的作用。主要結(jié)果如下： 1．12份供試雄性種質(zhì)花粉萌芽

2、率在20.1％-38.5％之間；除臺灣正柿及油柿外，其余試材的花粉均能在羅田甜柿的柱頭上萌發(fā)；雄株2號、雄株3號、雄株8號不含巨大花粉，其余試材有0.18％-4.44％不同比例的巨大花粉存在。 2．對29份柿屬雄性種質(zhì)RAPD分析結(jié)果如下：從118條隨機引物中篩選得到32條引物，共擴增得到499條譜帶，平均多態(tài)性比率87.17％，26個種質(zhì)特異性標(biāo)記，平均多態(tài)性信息含量為0.6097。3種方法(UPGMA法，ME法，Wagner

3、 簡約法)聚類分析表明：中國柿種質(zhì)與日本柿種質(zhì)明顯聚為2個類群，甜柿與澀柿不能截然分開；完全雄性資源同羅田甜柿親緣關(guān)系密切；湘西甜柿和日本甜柿關(guān)系密切，寶蓋甜柿和磨盤柿(羅田)親緣關(guān)系密切；3種聚類方法結(jié)果基本聚類分組結(jié)果類似，同時也存在極少數(shù)差異；主成分分析和主坐標(biāo)分析支持聚類分析結(jié)果。 3．建立了適合柿屬植物的ISSR分析技術(shù)體系：25μL反應(yīng)體系中，含l×Buffer，Mg<'2+>2.0或2.5mmol／L，dNTPs

4、 0.2mmol／L，引物0.6μmol／L，Taq DNA聚合酶1U，甲酰胺2％，模板DNA 2.4ng／μL；PCR擴增程序：94℃變性3min；94℃30s，(Tm+2)℃(根據(jù)引物不同設(shè)定)45s，72℃1.5min，35個循環(huán)；72℃延伸7min；2％瓊脂糖電泳分離PCR產(chǎn)物。對52份柿屬雄性種質(zhì)ISSR分析結(jié)果如下：從58條ISSR引物中篩選得到20條隨機引物，共擴增得到274條譜帶，平均多態(tài) 性比率92.33％，30個種

5、質(zhì)特異性標(biāo)記，平均多態(tài)性信息含量為0.7119。3種方法聚類分析結(jié)果表明中國柿種質(zhì)、日本柿種質(zhì)可以分成不同的3-5組，甜柿與澀柿雖不能截然分開，但甜、澀柿種質(zhì)基本可以分為不同的組，僅有2個完全甜柿種質(zhì)分在澀柿1組中；3個韓國澀柿品種和中國澀柿品種親緣關(guān)系密切，分組 結(jié)果和地理起源較為一致；完全雄性種質(zhì)和羅田甜柿親緣關(guān)系密切，寶蓋甜柿與磨盤柿(羅田)親緣關(guān)系密切，湘西甜柿同日本甜柿親緣關(guān)系密切；柿屬其它種明顯和栽培柿品種區(qū)分開，老鴉柿和

6、栽培柿品種親緣關(guān)系最遠，野柿和栽培柿品種親緣關(guān)系最近，油柿和栽培柿品種親緣關(guān)系近于君遷子，支持金棗柿作為獨立種；3種聚類方法結(jié)果有少部分出入，但基本分組結(jié)果一致；主成分分析和主坐標(biāo)分析支持聚類分析結(jié)果。 4. 28份柿屬種質(zhì)RAPD數(shù)據(jù)及ISSR數(shù)據(jù)比較整合結(jié)果表明：RAPD與ISSR相似系數(shù)矩陣的相關(guān)系數(shù)r=0.8624，匹配良好，二者結(jié)合能更好解釋柿屬種質(zhì)親緣關(guān)系；ISSR聚類分組結(jié)果與RAPD分析結(jié)果相同。二者多態(tài)性比率無

7、差異，多 態(tài)性信息含量也無差別。RAPD的標(biāo)記指數(shù)高于ISSR標(biāo)記。 5.優(yōu)化得到適合柿屬植物ITS-PCR技術(shù)體系：1×PCR Buffer，Mg<'2+>2.0mmol／L，dNTPs 0.2mmol／L，primer 0.25 μ mmol／L，0.05μL Taq DNA聚合酶，DMSO 5％，50ng模板DNA，其余雙蒸水補充體系，反應(yīng)總體積25 μ L；ITS-PCR擴增程序：97℃預(yù)變性5min；97℃變性30s

8、，57℃退火1min，72℃延伸lmin，35個循環(huán)；72℃延伸7min。 6.優(yōu)化得到適合柿屬植物AFLP分析技術(shù)體系參數(shù)：基因組DNA限制性內(nèi)切酶切先加入Mse I 65℃溫浴2h，然后加入EcoR I 37℃溫浴4h；采用5倍酶切連接產(chǎn)物稀釋液進行預(yù)擴增；預(yù)擴增反應(yīng)及選擇性擴增體系中Mg<'2+>濃度均為1.5mmol／L；預(yù)擴增反應(yīng)及選擇性擴增體系中dNTPs濃度分別為0.1mmol／L和 0.2mmol／L。其余參照