純鈦種植體表面納米形貌通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1-M2極化影響宿主成骨功能的研究.pdf

1、牙科種植技術(shù)已經(jīng)成為牙齒缺失和牙列缺損的重要修復(fù)方法,然而種植體-骨結(jié)合時間長及結(jié)合不良所導(dǎo)致的種植體失敗仍有發(fā)生,快速穩(wěn)定的骨結(jié)合是種植體材料研究的重要目標(biāo)。以往通過鈦種植體表面改性來促進(jìn)其成骨活性的研究主要關(guān)注骨形成細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng),然而隨著對種植體植入后組織反應(yīng)的不斷深入研究,目前認(rèn)為宿主的固有炎癥反應(yīng),尤其巨噬細(xì)胞的M1/M2極化狀態(tài)和炎性分泌功能會直接影響骨形成細(xì)胞的成骨分化及成骨/破骨平衡,是決定種植體預(yù)后的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因素。

2、因此,有必要就種植體表面改性對巨噬細(xì)胞極化及炎癥功能的影響進(jìn)行深入研究。本研究采用陽極氧化+UVA/C照射的方法在純鈦表面構(gòu)建出不同管徑的超親水TiO2納米管陣列的納米形貌,以人單核-巨噬細(xì)胞作為研究對象,對種植體表面納米形貌對巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)功能的影響進(jìn)行了全面的研究,并采用共培養(yǎng)的方法闡明了巨噬細(xì)胞通過旁分泌途徑對bMSCs的成骨功能的調(diào)節(jié)作用,最后將鈦種植體植入體內(nèi)以明確不同表面納米形貌的體內(nèi)成骨效果。本研究以巨噬細(xì)胞為切入點(diǎn),在

3、種植體材料體外成骨功能的系統(tǒng)研究模型中加入了對宿主炎癥反應(yīng)的考量,使體外模型更加接近體內(nèi)實(shí)際,從而更準(zhǔn)確地預(yù)測種植體植入后的組織反應(yīng),從炎癥調(diào)控的角度更加全面地指導(dǎo)種植體材料的表面優(yōu)化設(shè)計。
　　第一部分純鈦表面超親水TiO2納米管陣列形貌的制備與表征
　　【目的】在純鈦表面構(gòu)建不同管徑的TiO2納米管陣列形貌,為后續(xù)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供研究模型
　　【方法】拋光純鈦試樣,采用含0.28％氫氟酸和6%磷酸的電解液分別在5V

4、和20V電壓下進(jìn)行45min陽極氧化并在UVA/C下照射1H,采用場發(fā)射掃描電鏡觀察試樣表面形貌,原子力顯微鏡掃描試樣表面輪廓并測量粗糙度,蛋白洗脫法檢測試樣表面的蛋白吸附能力。
　　【結(jié)果】純鈦試樣表面經(jīng)陽極氧化和紫外線照射后形成超親水的納米管(NT)狀陣列形貌,5V和20V氧化電壓下形成的管徑分別為30nm(NT5)和80nm(NT20),納米管陣列的管徑越大粗糙度越大,不同形貌的純鈦試樣表面的蛋白吸附量沒有顯著差異。

5、　　【結(jié)論】陽極氧化和紫外線照射能夠在純鈦表面形成不同管徑的超親水TiO2納米管陣列形貌。
　　第二部分純鈦表面TiO2納米管形貌對人外周血單核-巨噬細(xì)胞形態(tài)及生存的影響
　　【目的】評價純鈦表面TiO2納米管形貌對人外周血單核-巨噬細(xì)胞黏附行為、形態(tài)變化及生存功能的影響。
　　【方法】使用梯度離心法和快速黏附法將人單核細(xì)胞從外周血中純化出來并接種于不同材料表面,采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的黏附行為,采用場發(fā)射掃

6、描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的生存和凋亡狀態(tài)。
　　【結(jié)果】單核-巨噬細(xì)胞在納米管形貌表面的發(fā)生顯著的黏附排斥作用,納米管管徑越小排斥作用越明顯;小管徑納米管形貌NT5誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呈盤狀鋪展而大管徑納米管形貌 NT20促進(jìn)巨噬細(xì)胞兩極化伸長;不同納米形貌表面的巨噬細(xì)胞生存/凋亡狀態(tài)沒有明顯差異。
　　【結(jié)論】納米管形貌可促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞從材料表面脫落,并根據(jù)納米管管徑不同誘導(dǎo)不同的細(xì)胞骨架伸展形態(tài),材料表面納

7、米形貌不會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　第三部分純鈦表面TiO2納米管形貌對人外周血單核-巨噬細(xì)胞M1/M2極化的影響
　　【目的】檢測鈦試樣不同的表面納米形貌對單核-巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)及炎性分泌功能的影響,明確從材料表面脫落的巨噬細(xì)胞是否仍具有炎性分泌功能。
　　【方法】將新鮮分離純化的單核-巨噬細(xì)胞接種于材料表面,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞膜表面及細(xì)胞內(nèi)的M1/M2極化標(biāo)志性分子的表達(dá)水平;采用 ELISA方法測定巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

8、上清中炎癥相關(guān)因子的分泌水平;采用實(shí)時定量PCR方法分別檢測材料表面黏附/脫落的巨噬細(xì)胞炎性因子的基因表達(dá)水平。
　　【結(jié)果】NT5形貌促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抑炎性的M2型極化,抑制炎性因子分泌并提高生長因子的分泌水平,大管徑納米管形貌促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生炎性M1型極化,促進(jìn)炎性因子的分泌,巨噬細(xì)胞的極化是由材料表面形貌直接誘導(dǎo)而非巨噬細(xì)胞自分泌的結(jié)果;材料表面黏附的巨噬細(xì)胞具有活躍的IL-1β、IL-6和IL-8的基因表達(dá),而材料表面脫落的

9、巨噬細(xì)胞則會喪失炎性因子的合成功能。
　　【結(jié)論】純鈦種植體材料通過表面形貌直接調(diào)控單核-巨噬細(xì)胞的極化方向和炎性因子分泌,從材料表面脫落的巨噬細(xì)胞會喪失炎癥分泌功能。
　　第四部分純鈦表面TiO2納米管形貌通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化影響宿主種植體-骨結(jié)合的體內(nèi)/外研究
　　【目的】檢測不同表面形貌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)物對bMSCs成骨分化功能的影響及bMSCs在巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)物作用下對巨噬細(xì)胞破骨分化的反饋性調(diào)節(jié),對不同形

10、貌鈦種植體的體內(nèi)炎癥和成骨功能進(jìn)行組織學(xué)觀察分析。
　　【方法】建立條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)模型,將原代培養(yǎng)的人 bMSCs接種于Transwell小室、培養(yǎng)板及不同形貌試樣表面,觀察巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)物對bMSCs的歸巢遷移、增殖功能及成骨分化的影響;檢測不同材料表面的bMSCs在巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)物的作用下通過合成釋放OPG/RANKL及M-CSF對巨噬細(xì)胞破骨分化的調(diào)節(jié)作用;對種植體植入后的種植體周圍的炎癥反應(yīng)和骨形成進(jìn)行組織學(xué)染色(HE染

11、色、免疫熒光染色、VG染色)觀察及半定量分析。
　　【結(jié)果】不同管徑的納米管形貌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)物均可促進(jìn)bMSCs的歸巢、增殖及成骨分化功能,且不同管徑之間沒有明顯差別;bMSCs在NT5形貌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)物刺激下抑制巨噬細(xì)胞的破骨分化,而在NT20形貌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)物刺激下促進(jìn)巨噬細(xì)胞的破骨分化;NT5形貌種植體的體內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤程度較低且具有最好的成骨能力,而NT20形貌種植體的體內(nèi)炎癥浸潤程度較高,其成骨作