純鈦種植體表面生物礦化構(gòu)建及對骨結(jié)合影響的研究.pdf

1、第一部分純鈦表面生物礦化處理工藝
　　目的：純鈦種植體表面形貌是影響種植體骨結(jié)合的重要因素之一，生物活性羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）涂層技術(shù)結(jié)合了金屬材料和HA的優(yōu)點，具有優(yōu)良的機(jī)械力學(xué)性能和生物活性，是常用的種植體表面處理方法。生物礦化是在生物體的嚴(yán)格控制下，從周圍環(huán)境中有選擇地吸收各種元素用于構(gòu)建生物體內(nèi)具有特殊功能的高度有序無機(jī)晶體結(jié)構(gòu)—礦物質(zhì)的過程。生物礦化的體外模擬采用模擬體液（Simulation

2、body fluid， SBF）等礦化液，模仿生物體內(nèi)的結(jié)晶環(huán)境，以沉積無機(jī)礦物質(zhì)。SBF具有和人體血漿相似的離子濃度，在SBF環(huán)境中沉積的HA與人體骨無機(jī)質(zhì)成分、結(jié)構(gòu)相似，有較好的生物活性。富自體濃縮生長因子（Concentrated Growth Factors，CGF）纖維蛋白液為血液提取物，離子濃度與血漿相近，且富含與骨修復(fù)再生密切相關(guān)的纖維蛋白和多種高濃度生長因子，可使生物礦化過程更接近體內(nèi)環(huán)境。本部分研究采用噴砂-酸蝕（Sa

3、nd Blast and Acid Etching，SLA）處理技術(shù)對鈦表面進(jìn)行預(yù)處理，分別使用SBF和CGF纖維蛋白液進(jìn)行生物礦化處理，制備出具有生物活性的礦化表面，通過掃描電鏡及X射線能譜儀觀察表面微形貌、測定微量元素組成。
　　方法：
　　1配置礦化液：按照Kokubo的模擬體液配方配制礦化液。
　　2制備CGF纖維蛋白液：抽取beagle犬靜脈血9ml，Medifuge離心機(jī)離心，分離上層清亮液體，置于一次性密

4、封塑料試管內(nèi)。
　　3鈦片分組及制備
　　純鈦片：圓形，直徑8mm，厚度1mm，粗糙度0.172μm。分為8組，每組3片：
　　A組：機(jī)械加工組；B組：噴砂酸蝕組；C組：SBF7天組，即機(jī)械加工的純鈦片置于SBF中，浸泡7天；D組：噴砂酸蝕+SBF7天組，即噴砂酸蝕的純鈦片置于SBF中，浸泡7天；E組：SBF14天組，即機(jī)械加工的純鈦片置于SBF中，浸泡14天；F組：噴砂酸蝕+SBF14天組，即噴砂酸蝕的純鈦片置于SB

5、F中，浸泡14天；G組：CGF組，即機(jī)械加工的純鈦片置于CGF中，浸泡7天；H組：噴砂酸蝕+CGF組，即噴砂酸蝕的純鈦片置于CGF中，浸泡7天
　　4樣品表面形貌、元素分析、表面微孔微球分布及粗糙度
　　使用 SEM-EDS觀察鈦片表面形貌，分析表面微量元素；使用 Nano Measure1.2測量表面孔徑、粒徑；使用粗糙度測試儀測量表面粗糙度。
　　結(jié)果：1鈦片表面SEM形貌：A組：鏡下見機(jī)械打磨劃痕排列整齊。B組：

6、低倍鏡下可見鈦片表面呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)；高倍鏡下見鈦片表面為網(wǎng)狀多級孔洞結(jié)構(gòu)，孔徑約0.2-4μm。C組：鏡下見機(jī)械打磨劃痕方向一致，未見明顯礦化沉積物存在。D組：低倍鏡下見鈦片表面呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)，可見少量礦化結(jié)節(jié)；高倍鏡下鈦片表面見礦化結(jié)節(jié)不規(guī)則，粒徑約0.3-5μm。E組：低倍鏡下可見方向一致的劃痕，可見少量礦化結(jié)節(jié)；高倍鏡下見礦化沉積物呈不規(guī)則片狀，粒徑約0.2-3μm。F組：低倍鏡下可見鈦片表面大面積球狀沉積物覆蓋；高倍鏡下見沉積物呈分

7、散性好的多孔球狀，球徑約1-3μm，球體表面見細(xì)小針狀納米粒子，形成發(fā)達(dá)的多孔孔隙結(jié)構(gòu)。G組：低倍鏡下可見方向一致的劃痕，表面見少量礦化結(jié)節(jié)；高倍鏡下見，礦化沉積物呈不規(guī)則高密度團(tuán)塊狀，粒徑約0.2-4μm。H組：低倍鏡下見鈦片呈現(xiàn)蜂窩狀結(jié)構(gòu)，可見少量礦化結(jié)節(jié)；高倍鏡下見礦化結(jié)節(jié)呈不規(guī)則團(tuán)塊狀，粒徑約0.3-5μm；2 EDS分析結(jié)果：A、B、C組表面元素均為Ti；D、E、F、G、H組：表面元素均為C、O、P、Ca、Ti，其中Ca的原子

8、百分比分別為3.41％、4.62%、9.73%、6.28%、6.81%，P的原子百分比分別為2.33%、2.82%、6.24%、4.12%、4.97%，Ca/P比分別為1.46、1.64、1.56、1.52、1.37；3 Nano Measure1.2測量結(jié)果：B組鈦片表面微孔孔徑：平均孔徑1.28μm，0.5-3μm微孔所占比例為81%；D組、E組、G組、H組：表面礦化沉積物平均粒徑分別為1.55μm、0.98μm、1.68μm、2.

9、42μm；F組：表面微球平均粒徑1.19μm；微球表面納米粒子平均長度210nm，寬度40nm，形成平均孔徑110nm的多孔孔隙結(jié)構(gòu)；4表面粗糙度測量結(jié)果：B組＞A組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；A組、C組、E組、G組相比，E組＞G組＞A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；C組＞A組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；B組、D組、F組、H組相比，F(xiàn)組＞D組＞B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），F(xiàn)組＞H組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　第二

10、部分純鈦表面生物礦化處理對前成骨細(xì)胞增殖分化的影響
　　目的：成骨細(xì)胞在種植體表面的黏附、增殖和分化是骨結(jié)合形成的關(guān)鍵。通過機(jī)械、化學(xué)、生物等表面改性技術(shù)可有效改善材料與細(xì)胞的相容性，從而影響成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為。從仿生學(xué)角度來講，微納米級的HA可顯著增加成骨細(xì)胞的粘附、增殖、ALP活性和鈣磷沉積，通過生物礦化手段，制備具有微納米復(fù)合形貌的鈦表面可能更有利于細(xì)胞的功能表達(dá)。本部分實驗通過直接熒光染色、MTT法、ALP活性檢測評價M

11、C3T3-E1細(xì)胞在各組鈦片表面黏附、增殖和分化功能的差異，從細(xì)胞水平揭示成骨細(xì)胞在不同表面處理鈦片的附著機(jī)理及功能性分化機(jī)制。
　　方法：
　　1鈦片分組及制備：A組：機(jī)械加工組；B組：噴砂酸蝕組；C組：噴砂酸蝕+SBF7天組；D組：噴砂酸蝕+SBF14天組；E組：噴砂酸蝕+CGF組，表面處理方法同第一部分。
　　2 MC3T3-E1細(xì)胞的礦化誘導(dǎo)及礦化結(jié)節(jié)的鑒定
　　使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對 MC3T3-E1細(xì)胞

12、進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，硝酸銀染色和茜素紅染色鑒定鈣結(jié)節(jié)，ALP染色評價ALP活性。
　　3采用直接熒光染色、MTT法、ALP活性檢測評價MC3T3-E1細(xì)胞在各組鈦片表面黏附、增殖和分化功能的差異。
　　結(jié)果：1 MC3T3-E1細(xì)胞的礦化誘導(dǎo)及成骨分化活性的鑒定：礦化誘導(dǎo)14天時茜素紅染色、硝酸銀染色和ALP染色結(jié)果均為陽性；2細(xì)胞在鈦片表面的伸展情況：接種后48h，A組鈦片表面細(xì)胞呈板狀伸展鋪開，細(xì)胞大而扁平呈多角形，F(xiàn)-act

13、in遍布細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。B組、C組、D組和E組鈦片表面細(xì)胞F-actin束狀相互交錯，排列欠規(guī)整，細(xì)胞間突觸廣泛連接。其中D組鈦片表面細(xì)胞伸出更多毛刺狀突起和更長的偽足；3 MTT檢測結(jié)果：培養(yǎng)1d時，OD值D組＞A組、B組和C組，E組＞A組、B組和C組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。D組＞E組，C組＞B組＞A組，但兩兩比較差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。培養(yǎng)3d、5d和7d時，D組＞E組＞C組＞B組＞A組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）

14、；4 ALP活性檢測結(jié)果：隨培養(yǎng)時間的延長，五組ALP的比活力逐漸升高：培養(yǎng)4d時，D組＞B組＞A組，D組＞C組和 E組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），E組＞C組，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；培養(yǎng)7d和14d時，D組＞E組＞C組＞B組＞A組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　第三部分純鈦表面生物礦化處理對前成骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜差異分析
　　目的：基因芯片是以基因序列為分析對象，以基因探針和雜交測序技術(shù)為基礎(chǔ)的一種高

15、效快速的核酸序列分析技術(shù)，全基因組 mRNA表達(dá)芯片可同時檢測樣本幾乎所有已知基因的轉(zhuǎn)錄水平，有利于篩選出變化明顯的差異基因。小鼠前成骨細(xì)胞 MC3T3-E1細(xì)胞是研究骨形成機(jī)制的經(jīng)典細(xì)胞，在第二部分的研究中，我們建立了可靠且可重復(fù)的 MC3T3-E1體外誘導(dǎo)成骨模型，本部分實驗通過全基因表達(dá)譜差異分析技術(shù)檢測差異表達(dá)基因及相關(guān)的信號通路，從基因水平探討純鈦不同表面形貌對成骨細(xì)胞骨改建的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：
　　1鈦

16、片分組及制備同第二部分。
　　2 TRIZOL法提取總RNA：于MC3T3-E1細(xì)胞礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后7d、14d兩個時間點收集鈦片表面細(xì)胞，提取總 RNA，并測定其濃度、純度和完整性。
　　3全基因組mRNA表達(dá)譜芯片的制備。
　　4基因芯片的掃描和數(shù)據(jù)分析
　　使用Transcriptome Analysis Console_3_0軟件掃描分析數(shù)據(jù)，篩選出上調(diào)或下調(diào)兩倍以上的基因，使用Pathway分析篩選差異基

17、因及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　結(jié)果：1總RNA純度、完整性檢測：各組樣本RNA純度、濃度和完整性均符合實驗要求；2表達(dá)譜芯片檢測分析結(jié)果：2.1 B組與A組相比，礦化誘導(dǎo)7天時，2倍以上差異基因共4027個（2255個上調(diào)，1772個下調(diào)）；14天時，2倍以上差異基因共2934個（1599個上調(diào)，1335個下調(diào)），在兩個時間段均出現(xiàn)Tgfbr1基因的上調(diào)；2.2 C組與A組相比，礦化誘導(dǎo)7天時，2倍以上差異基因共4087個（220

18、2個上調(diào)，1885個下調(diào)）；14天時，2倍以上差異基因共3135個（1956個上調(diào)，1179個下調(diào)），在兩個時間段均出現(xiàn)上調(diào)的基因有：Araf、Sipa1、Map2k7、Rasa3、Thbs1、Apc和Lrp1；2.3 D組與A組相比，礦化誘導(dǎo)7天時，2倍以上差異基因共4540個（2550個上調(diào)，1990個下調(diào)）；14天時，2倍以上差異基因共3043個（1745個上調(diào)，1298個下調(diào)），Bmp4明顯上調(diào)。在兩個時間段均出現(xiàn)上調(diào)的基因有：

19、Prkcd、Sipa1和Ski；2.4 E組與A組相比，礦化誘導(dǎo)7天時，2倍以上差異基因共4073個（2416個上調(diào)，1657個下調(diào)）；14天時，2倍以上差異基因共篩選出3535個（2448個上調(diào)，1087個下調(diào)），Runx2基因明顯上調(diào)。在兩個時間段均出現(xiàn)上調(diào)的基因有Smad3和Sipa1；2.5 D組與C組相比，礦化誘導(dǎo)7天時，2倍以上差異基因共912個（461個上調(diào)，451個下調(diào)）；14天時，2倍以上差異基因共668個（332個上

20、調(diào)，336個下調(diào)），在兩個時間段均出現(xiàn)上調(diào)的基因有：Bmp4和Foxh1；2.6 E組與C組相比，礦化誘導(dǎo)7天時，2倍以上差異基因共2127個（1277個上調(diào)，850個下調(diào)）；14天時，2倍以上差異基因共387個（285個上調(diào)，102個下調(diào)），兩個時間段與成骨相關(guān)的基因未見重疊。調(diào)整差異倍數(shù)為1.5倍時，兩個時間段均出現(xiàn)上調(diào)的成骨相關(guān)基因有Jun和Inhba；2.7 D組與E組相比，礦化誘導(dǎo)7天時，2倍以上差異基因共1487個（716個

21、上調(diào)，771個下調(diào)）；14天時，2倍以上差異基因共826個（329個上調(diào)，497個下調(diào)），在兩個時間段均出現(xiàn)Bmp4的上調(diào)；3差異基因Pathway分析：差異基因主要涉及了20條途徑，其中與成骨分化關(guān)系密切的有Wnt信號通路、MAPK信號通路和TGF-β信號通路。
　　第四部分純鈦種植體表面生物礦化處理對骨結(jié)合的影響
　　目的：種植體表面生物礦化處理可以改變種植體與骨組織的結(jié)合方式，提高界面結(jié)合強度，加速骨結(jié)合進(jìn)程，縮短種植

22、修復(fù)的愈合期，具有良好的生物活性。本部分研究建立了成年beagle犬人工種植牙動物模型，采用金屬-骨組織聯(lián)合磨片技術(shù)觀察種植體與骨組織的結(jié)合，分析評價生物礦化種植體表面促進(jìn)骨結(jié)合、增加骨結(jié)合力的機(jī)制，為設(shè)計具有優(yōu)良表面形貌結(jié)構(gòu)的人工牙種植體、提高人工種植牙的成功率提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1實驗動物：成年健康雄性Beagle犬15只。
　　2種植體分組及制備
　　埋置式純鈦螺紋種植體，直徑3.5mm，長度8

23、mm，分為5組，每組18枚，共90枚，種植體的表面處理方法同第二部分鈦片表面處理。
　　3 Beagle犬拔牙后延期種植動物模型的建立
　　全麻下拔除Beagle犬下頜第一、二、三、四前磨牙，三個月后將90顆種植體植入beagle犬雙側(cè)下頜骨內(nèi)。
　　4標(biāo)本留取與處理
　　分別于術(shù)后4、8、12周處死動物，進(jìn)行大體觀察并拍攝X線片以觀察骨愈合情況。一半標(biāo)本隨即進(jìn)行旋出扭力測試，另一半標(biāo)本固定后制備硬組織切片。

24、r>　　5組織學(xué)觀察和骨計量學(xué)
　　在熒光顯微鏡下觀察并測量計算骨礦化沉積率；硬組織切片染色后顯微鏡觀察界面成骨情況，測量并計算骨結(jié)合指數(shù)和種植體周圍骨鈣化面積百分率，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　結(jié)果：1種植術(shù)后X線觀察：術(shù)后4w、8w、12w時，X線片和CBCT觀察種植體周圍均未見異常透射影像，頸部垂直骨吸收均小于2mm；2雙熒光標(biāo)記結(jié)果：術(shù)后4w，種植體周圍可見散在黃、綠色熒光，A組和B組黃色熒光主要集中在種植窩壁上

25、、C組、D組和E組在種植體表面和周圍窩壁均可見黃色熒光；術(shù)后8w，熒光顯色的范圍和數(shù)量較4w時明顯增加，黃色熒光呈片狀、綠色熒光呈線狀分布，與種植體相接觸，并沿種植窩壁向螺紋內(nèi)部生長，C組、D組和E組螺紋凹槽底部見有部分熒光分布；術(shù)后12w，A組、B組熒光條帶主要集中在周圍骨創(chuàng)區(qū)，種植體表面較少。C組、D組和E組種植體表面和相應(yīng)的骨表面均有黃色熒光條帶，并有綠色條帶將其連接在一起；3硬組織切片組織學(xué)觀察：術(shù)后4周，種植體螺紋間充滿稀疏新

26、生編織骨，自備洞骨緣向螺紋斜面爬行生長。和A組、B組相比， C組、D組和E組種植體骨小梁量較多，排列較為致密；術(shù)后8周，種植體周圍新生骨量較4周時明顯增加，新生骨沿螺紋斜面爬行至螺紋底部，新生骨小梁骨髓腔變?。恍g(shù)后12周，新生骨排列致密有序，形成板層結(jié)構(gòu)， A組和B組種植體-骨的接觸主要集中在種植體螺紋頂端和斜壁，C組、D組和E組種植體-骨的接觸主要集中在螺紋底部凹槽，接觸成骨現(xiàn)象更加明顯；4統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果：4.1種植體旋出扭力峰值，術(shù)

27、后4w時，D組＞E組＞C組＞B組＞A組，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后8w時，扭力峰值D組＞E組＞C組＞B組＞A組，B組＞A組，D組＞E組＞C組，除C組＞B組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后12w時，扭力峰值D組＞C組＞B組＞A組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），D組＞E組，E組＞C組，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；4.2礦化沉積率（MAR）4w、12w時，D組＞E組＞C組＞B組＞A組，各

28、組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后8w時，D組＞E組＞C組＞B組＞A組，E組和C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；4.3骨結(jié)合指數(shù)(OI%)：術(shù)后4w和8w時，D組＞E組＞C組＞B組＞A組，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后12w時，D組＞E組＞C組＞B組＞A組，除E組和C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P<0.05）；4.4種植體周圍骨鈣化面積百分率（

29、CA%)：術(shù)后4w時，D組＞E組＞C組＞B組＞A組，除E組和C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；術(shù)后8w和12w時， D組＞E組＞C組＞B組＞A組，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1純鈦表面不同基礎(chǔ)處理對生物礦化效果有影響，經(jīng)噴砂酸蝕表面基礎(chǔ)處理可獲得微納米多級孔洞結(jié)構(gòu)，有利于生物礦化形成。
　　2礦化時間對礦化效果有影響，SBF2周礦化處理礦化質(zhì)量優(yōu)于

30、1周礦化處理。
　　3 CGF纖維蛋白液礦化處理效果優(yōu)于SBF生物礦化液。
　　4小鼠前成骨細(xì)胞 MC3T3-E1體外礦化誘導(dǎo)14天即可出現(xiàn)礦化成骨，是體外研究生物材料對細(xì)胞黏附、增殖功能影響的可靠細(xì)胞。
　　5純鈦表面處理形成不同的形貌結(jié)構(gòu)，可影響 MC3T3-E1細(xì)胞的黏附伸展、增殖和分化。
　　6純鈦表面經(jīng)CGF纖維蛋白液、SBF礦化處理有利于MC3T3-E1細(xì)胞的黏附伸展、增殖和分化。
　　7純鈦表

31、面不同處理可導(dǎo)致 MC3T3-E1細(xì)胞基因表達(dá)差異，通過基因表達(dá)差異分析可推斷不同表面處理通過不同的信號通路影響細(xì)胞的黏附、增殖、分化和成骨。
　　8噴砂酸蝕處理可上調(diào)Tgfbr1基因，推測其促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化可能與TGF-β信號通路有關(guān)。
　　9 SBF生物礦化處理可上調(diào)Map2k7、Bmp4基因，推測SBF生物礦化可能通過Wnt、MAPK和TGF-β信號通路促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、成骨分化。
　

32、　10 CGF生物礦化處理可上調(diào)Runx2、Smad3基因，推測CGF生物礦
　　化可能通過MAPK、TGF-β信號通路促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、成骨分化。
　　11純鈦種植體表面經(jīng)不同方法處理形成不同的形貌結(jié)構(gòu)，對種植體骨結(jié)合形成方式有影響。
　　12單純機(jī)械加工種植體的骨結(jié)合形成方式主要為距離成骨；經(jīng)噴砂酸蝕處理純鈦種植體表面有部分接觸成骨；生物礦化處理純鈦種植體表面的成骨方式均為雙向成骨。
　　13 S