脂肪干細(xì)胞對糖尿病兔種植體周圍植骨及骨結(jié)合影響的實驗研究.pdf

1、糖尿病已成為全球性的公共健康問題,糖尿病缺牙患者的種植失敗率較正常缺牙患者偏高。糖尿病缺牙患者缺牙區(qū)往往伴有牙槽骨缺損,其植骨效果也較正常缺牙患者差。如何提高糖尿病缺牙患者的種植修復(fù)成功率并研究出適合糖尿病缺牙患者的植骨材料一直是個難題。
　　種植修復(fù)失敗是糖尿病的并發(fā)癥之一,其發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)與糖尿病其他并發(fā)癥類似。糖尿病患者在長期高血糖狀態(tài)下,細(xì)胞線粒體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),生成的過氧化物和超氧自由基激活PKC通路、多元醇通路

2、、己糖胺通路,形成糖基化終產(chǎn)物,損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,造成微血管病變。
　　糖尿病患者的代謝紊亂包括高血糖、代謝性酸中毒和胰島素不足。持續(xù)的高血糖不僅會破壞骨質(zhì),還會影響骨質(zhì)沉積、改建和礦化。胰島素不足或胰島素抵抗可導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)目減少,使成骨活性降低,抑制骨鈣素合成,引起骨質(zhì)疏松,造成種植體骨結(jié)合較差。AGEs刺激單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、炎性介質(zhì),影響骨質(zhì)生成并加速骨質(zhì)吸收。AGEs可與成骨細(xì)胞表面的受體結(jié)合,抑制成骨

3、細(xì)胞分化,使成骨細(xì)胞數(shù)量及活性下降。針對糖尿病患者種植區(qū)域成骨細(xì)胞數(shù)量減少、活性下降,本研究通過組織工程技術(shù),增加種植區(qū)域成骨細(xì)胞數(shù)量,增強其成骨能力。
　　研究目的:
　　本課題通過建立新西蘭兔糖尿病模型,在新西蘭兔脛骨干骺端植入純鈦種植體,并將ASCs加載于種植體周圍,觀察其對新骨生成以及種植體骨結(jié)合的影響,探討ASCs在成骨及種植體骨結(jié)合中的可能作用機制,為提高糖尿病缺牙患者種植修復(fù)成功率提供新思路和理論依據(jù)。

4、　　實驗方法和結(jié)果:
　　第一部分:
　　方法:將新西蘭兔耳緣靜脈備皮、消毒。以戊巴比妥鈉(3％,40mg/Kg)耳緣靜脈注射麻醉,經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射新鮮配制的四氧嘧啶(Alloxan,ALX)(50mg/ml,100mg/Kg)。分別于注藥后第2h、4h、6h皮下注射5%葡萄糖溶液共10mL,預(yù)防低血糖,并在24h內(nèi)提供10%葡萄糖飲水。建模期間每24h檢測一次血糖,當(dāng)空腹血糖(FastingBloodGlucose,FB

5、G)高于19.4mmol/L時,皮下注射胰島素(1-4U/Kg)。建模后正常飼養(yǎng)5周,每周檢測血糖及體重【1】。以FBG穩(wěn)定在13.9mmol/L以上為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.靜脈注射ALX24-48h后新西蘭兔出現(xiàn)萎靡、活動減少、食欲減退等癥狀。3d后開始出現(xiàn)多飲、多食、多尿等糖尿病癥狀。2只新西蘭兔在ALX靜脈給藥24h內(nèi)死亡,2只在給藥后一周內(nèi)死亡,其余均存活,另2只新西蘭兔因空腹服血糖未達到13.9mm

6、ol/L而被排除。
　　2.剩余14只新西蘭兔經(jīng)靜脈注射ALX后空腹血糖由(5.92±0.75)mmol/L增加至(19.51±5.19)mmol/L,并穩(wěn)定在13.9mmol/L以上。新西蘭兔的體重較給藥前有不同程度減輕(0.2-0.5Kg)。體重和血糖值與建模前相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。小結(jié):
　　利用ALX選擇性破壞新西蘭兔胰島β細(xì)胞,可使之出現(xiàn)糖尿病的癥狀,是建立糖尿病模型的有效手段。ALX靜脈注射后

7、,新西蘭兔血糖升高,體重逐漸下降,并出現(xiàn)多飲多食多尿等糖尿病癥狀。ALX在中性水溶液中不穩(wěn)定,在使用時應(yīng)新鮮配制。由于ALX毒性較大,應(yīng)注意加強監(jiān)測血糖,并及時做相應(yīng)處理,降低實驗動物死亡率。
　　第二部分
　　方法:以戊巴比妥鈉(3%,40mg/Kg)耳緣靜脈注射麻醉新西蘭兔,在無菌條件下切取腹股溝脂肪組織約3ml。去除肉眼可見的血管和筋膜,PBS沖洗后用眼科剪將脂肪組織剪成糜狀,以0.25%Ⅰ型膠原酶消化60min。將消

8、化離心獲取的ASCs在37℃,50ml/LCO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)。3d后首次換液,待細(xì)胞融合達90%時按1:3傳代。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),拍照。取第3-5代ASCs,以成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化,然后分別進行油紅O染色和茜素紅染色。倒置顯微鏡下觀察,拍照。
　　結(jié)果:
　　1.初分離的ASCs呈圓形,直徑約5μm,色深;接種4h后細(xì)胞開始貼壁,在最初的24-48h內(nèi)細(xì)胞生長處于停滯期,48-72h后細(xì)胞完

9、全貼壁、伸展,呈成纖維細(xì)胞樣并集落樣生長。
　　2.成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖速度明顯降低,細(xì)胞由長梭形變?yōu)闄E圓形、三角形;誘導(dǎo)5天后細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)小脂滴,隨后脂滴逐漸增多增大,細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴;油紅O染色陽性。
　　3.成骨誘導(dǎo)分化3天后細(xì)胞由梭形變?yōu)楸鈭A形,細(xì)胞核變圓,細(xì)胞體增大,胞膜有偽足伸展,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒逐漸增多;細(xì)胞呈集落樣生長,細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積,細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu),形成鈣結(jié)節(jié);茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)。

10、小結(jié):
　　本實驗成功地從新西蘭兔脂肪組織中分離獲取了ASCs,傳代培養(yǎng)后,經(jīng)多向誘導(dǎo)分化證實ASCs具有干細(xì)胞活性。ASCs來源豐富、易于獲取、體外擴增能力強、不涉及倫理和法律限制,是理想的組織工程種子細(xì)胞。以ASCs為種子細(xì)胞的組織工程技術(shù)在口腔種植中有著廣闊的應(yīng)用前景,有望解決糖尿病缺牙患者的種植修復(fù)難題。
　　第三部分:
　　方法:將建模成功的新西蘭兔以戊巴比妥鈉(3%,40mg/Kg)耳緣靜脈注射麻醉,固定于

11、手術(shù)操作臺上。將雙側(cè)脛骨膝關(guān)節(jié)處備皮消毒,沿脛骨骺端內(nèi)側(cè)平面切開皮膚,分離肌肉及筋膜,暴露脛骨面;生理鹽水冷卻下,用小球鉆及擴孔鉆在脛骨平面中央逐級預(yù)備種植窩,植入經(jīng)微弧氧化表面處理的純鈦種植體(規(guī)格:3.3x6mm),植入深度約2mm;用小球鉆在種植體周圍制備出血孔,為植骨材料提供血供。將實驗動物的雙側(cè)脛骨隨機分配到實驗組和對照組。在實驗組種植體周圍植入0.3mlASCs懸液(濃度1x108/ml)與50mgBio-Oss骨粉的混合物

12、;對照組種植體周圍植入等量生理鹽水與Bio-Oss骨粉的混合物。然后以鈦帽將植骨材料覆蓋在種植體上,用微型螺絲固定【2】。分層嚴(yán)密縫合手術(shù)切口。術(shù)后肌注硫酸慶大霉素(40萬U/日)3-5天,觀察傷口愈合情況。分別于術(shù)后第4、8、12周取材,進行Micro-CT掃描分析,硬組織切片,并行麗春紅染色。觀察植骨區(qū)骨質(zhì)生成情況及種植體骨結(jié)合情況。
　　結(jié)果:
　　1.術(shù)后有2只新西蘭兔因傷口感染而被排除,其余12只傷口愈合良好。分別

13、于術(shù)后第4、8、12周取雙側(cè)脛骨標(biāo)本,去除軟組織和鈦帽后可見種植體被新生骨質(zhì)和植骨材料覆蓋,未見軟組織增生。
　　2.Micro-CT三維重建圖像可見:術(shù)后4周時,新西蘭兔雙側(cè)植骨區(qū)距種植體1.0mm區(qū)域均有少量新骨生成,實驗組和對照組差異不明顯;而術(shù)后8周和12周時,實驗組植骨材料之間可見較多新生骨質(zhì),骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)高于對照組(p<0.05)。
　　3.麗春紅三色染色顯示:術(shù)后4周時,實驗組和對照組均有新生骨質(zhì)生

14、成,兩者差異不明顯;術(shù)后8周時,對照組植骨材料周圍新生骨骨量仍然較少,較稀疏,而實驗組植骨材料已逐步被新生骨所取代;術(shù)后12周時,實驗組植骨材料之間有較多新生骨,新生骨組織與種植體實現(xiàn)骨結(jié)合,而對照組植骨材料之間新生骨組織較少,連續(xù)性差,新生骨與種植體的骨結(jié)合亦不如實驗組。
　　小結(jié):
　　本實驗利用組織工程技術(shù),把ASCs與Bio-Oss骨粉復(fù)合后植于糖尿病兔種植體周圍。術(shù)后8周和12周檢測結(jié)果顯示,實驗組的成骨狀況以及種

15、植體的骨結(jié)合情況均優(yōu)于對照組。提示將ASCs局部應(yīng)用于種植體周圍,可在一定程度上提高糖尿病缺牙患者的種植成功率。
　　結(jié)論:
　　1.新西蘭兔耳緣靜脈注射ALX(100mg/kg)可以建立穩(wěn)定的糖尿病動物模型。但應(yīng)注意血糖管理,降低死亡率。
　　2.兔脂肪組織可以分離獲取ASCs,ASCs易于傳代及擴增。經(jīng)多向誘導(dǎo)分化鑒定證實,獲取的ASCs具有干細(xì)胞活性。
　　3.將ASCs加載于種植體周圍,術(shù)后8周、12周可