龍眼品種的ISSR分析及焦核性狀的分子標(biāo)記研究.pdf

1、龍眼是我國南方亞熱帶特產(chǎn)名貴水果，我國科學(xué)工作者已就龍眼分類和鑒別做了一些工作，但已有的研究仍然存在部分品種分類結(jié)果不一致的現(xiàn)象，不利于龍眼生產(chǎn)發(fā)展；并且近年來福建省新選育(發(fā)現(xiàn))了一些新的株系，其親緣關(guān)系有待研究和證實(shí)；此外，在福建省陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些龍眼焦核單株，這些單株的親緣關(guān)系未見有較為全面的研究報(bào)道。本研究建立龍眼ISSR技術(shù)體系，運(yùn)用ISSR技術(shù)進(jìn)行龍眼遺傳多樣性的分子評價(jià)和分類研究，分析一些新選育單株(株系)和焦核單株的親緣關(guān)

2、系；同時(shí)，尋找與龍眼焦核性狀相關(guān)的ISSR分子標(biāo)記，為焦核龍眼的選育種提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1、龍眼葉片DNA提取方法的改進(jìn)：龍眼葉片中富含色素、單寧和多糖，采用改良CrAB法從龍眼葉片提取較高質(zhì)量的DNA。龍眼葉片研磨后，加入丙酮抽提這一步驟，可有效去除色素和單寧，對于老葉，可進(jìn)行2-3次反復(fù)抽提；在DNA中加入1/10體積乙醇，1/30體積Na．Ac,冰浴1小時(shí)，再加入等體積氯仿混勻，1000g離心10min,吸取上

3、清，重新沉淀DNA可去除龍眼中富含的多糖。 2、龍眼ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：建立適合龍眼的ISSR技術(shù)體系。龍眼ISSR-PCR反應(yīng)最佳體系是：20μL體積中，模板DNA 25 ng，引物0.2μmol/L，dNTPs 100 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，MgCl<,2> 2.5 m mol/L，10×PCR緩沖液2,5μL。ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的優(yōu)化程序是：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1mi

4、n，52℃退火1 min，72℃延伸90s，41個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，退出。 3、龍眼遺傳資源的ISSR分析：篩選來自Llniversity of British Columbia．Biotechnology Lab(UBCBL)的100個(gè)引物，獲得12條多態(tài)性明顯的引物；以這12條引物分析龍眼51份樣品，共產(chǎn)生155條擴(kuò)增帶，平均每個(gè)引物產(chǎn)生的條帶為12.9，不同引物獲得的擴(kuò)增帶從10條～16條不等，其中最多的uBC8

5、73，為16條，最少的是UBC840產(chǎn)生10條酶帶，DNA擴(kuò)增酶帶的多態(tài)性為95.4％，說明51份材料具有遺傳多樣性。根據(jù)ED法計(jì)算各樣品間的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法進(jìn)行龍眼親緣關(guān)系分析，建立親緣關(guān)系聚類樹狀圖。以結(jié)合距離D=0.55為界，本研究可以將51份龍眼遺傳資源分為中國龍眼和泰國龍眼兩大類型，以D=0.27為界時(shí)，把供試的46份中國龍眼遺傳資源分為8組。 4、焦核性狀I(lǐng)SSR分子標(biāo)記研究：采用集團(tuán)分離分析(Bulk

6、edsegregantanalysis,BSA)方法，等量混合焦核單株的DNA構(gòu)建焦核池Pc，等量混合非焦核單株的DNA,構(gòu)建非焦核池Ps，ISSR擴(kuò)增兩個(gè)池間的差異片段。從12多態(tài)性高的引物中篩選到引物UBC842在焦核池中擴(kuò)增出特異的約666bp DNA條帶，在8個(gè)焦核單株和8個(gè)非焦核品種間的擴(kuò)增進(jìn)一步證實(shí)666bpDNA條帶只存在于焦核單株中，而在非焦核品種中沒有該片段，從而初步認(rèn)為引物UBC842擴(kuò)增出的666bp DNA條帶與