桃紅色果肉性狀的分子標(biāo)記及序列分析.pdf

1、由于桃世代周期長(zhǎng)，利用傳統(tǒng)的育種方法培育一個(gè)新品種需要10多年的時(shí)間，并且樹(shù)體高大，進(jìn)行雜交選種時(shí)需要占用大量的土地。近年來(lái)興起的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)可以有效縮短育種周期。在桃性狀的分子標(biāo)記方面前人已經(jīng)做了大量的工作。在桃果實(shí)性狀分子標(biāo)記方面，已研究了果實(shí)果肉黃色和白色、有毛/無(wú)毛、果實(shí)非酸/酸性狀、和果實(shí)成熟期等，對(duì)果實(shí)中不同部位花青素分布的分子標(biāo)記還未見(jiàn)報(bào)道。SRAP標(biāo)記技術(shù)是一種多態(tài)性和信息量豐富的新型分子標(biāo)記技術(shù)，近年來(lái)在植物遺

2、傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖的構(gòu)建以及比較基因組學(xué)研究等方面得到廣泛應(yīng)用。我們利用梯度PCR技術(shù)，對(duì)SRAP-PCR過(guò)程中的兩步退火溫度進(jìn)行了研究，以期獲得較好的退火溫度組合。我們利用桃品種的兩個(gè)雜交群體重陽(yáng)紅×燕紅和重陽(yáng)紅×大久保的后代，應(yīng)用優(yōu)化后的SRAP反應(yīng)條件以及利用SSR標(biāo)記等兩種標(biāo)記方法結(jié)合BSA方法對(duì)桃果肉不同部分的紅色素進(jìn)行了標(biāo)記研究，并對(duì)獲得的與桃果實(shí)近核色素緊密連鎖的SRAP標(biāo)記Me07Em02擴(kuò)增得到的片段進(jìn)

3、行了回收、測(cè)序和分析，并登錄桃基因組Peach v1.0進(jìn)行了比對(duì)。研究結(jié)果如下:
　　 1.SRAP-PCR退火溫度的優(yōu)化:根據(jù)已有文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了8條正向引物和11條反向引物，組合成88對(duì)引物，利用梯度PCR儀(型號(hào):MJ200PCR)，對(duì)SRAP-PCR過(guò)程中的兩步退火溫度進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)第一步前5輪循環(huán)的退火溫度梯度(37.0℃，37.3℃，38.1℃，39.1℃、40.6℃，42.5℃，44.7℃，46.5℃，48.0℃，

4、49.0℃，49.7℃，50.0℃)的實(shí)驗(yàn)，其退火溫度可提高到41℃;對(duì)第二步后30輪循環(huán)的退火溫度梯度(50.0℃，50.3℃，50.9℃，51.7℃，52.8℃，54.3℃，56.0℃，57.4℃，58.5℃，59.3℃，60.0℃)的實(shí)驗(yàn)，其退火溫度可提高到52℃，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同的退火溫度可擴(kuò)增出不同的條帶，并非隨著退火溫度的提高，可擴(kuò)增條帶減少，有些條帶較高退火溫度下出現(xiàn)。應(yīng)用該程序，使用多個(gè)SRAP引物組合在桃品種進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，

5、均獲得了良好的重復(fù)性結(jié)果。
　　 2.以“重陽(yáng)紅”與“燕紅”兩個(gè)桃(Prunus persica(L.) Batsch)品種為親本構(gòu)建群體，通過(guò)對(duì)正交F1代果實(shí)果肉紅色素多年的調(diào)查，分別對(duì)紅色素在皮下、果肉和近核果肉的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在此基礎(chǔ)上采用分離群體分組分析（bulked segregate analysis，BSA）法，將果肉紅色素在果肉三個(gè)部位的分布分別記為“有”和“無(wú)”兩個(gè)基因池，共3對(duì)6個(gè)基因池。應(yīng)用優(yōu)化后的相關(guān)序列

6、擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)和簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)分子標(biāo)記技術(shù)法篩選與桃果肉紅色素不同部位分布性狀基因連鎖的分子標(biāo)記。通過(guò)對(duì)88對(duì)SRAP引物組合和分別來(lái)自桃屬（Prunus persica）和蘋(píng)果(Malus(x)domestica)的481對(duì)SSR引物組合同時(shí)在6個(gè)基因池間進(jìn)行篩選，在各基因池間共篩選出4對(duì)SRAP引物組合（Me01Em08、Me05Em03、Me07Em04和Me07Em02）和5對(duì)SSR引物(UDP97-402、BP

7、PCT023、 UDP96-003、CH04g09、CPPCT028)。經(jīng)138個(gè)單株的驗(yàn)證，該標(biāo)記穩(wěn)定出現(xiàn)。采用作圖軟件Mapmaker和回交群體模型進(jìn)行標(biāo)記分群和連鎖分析，設(shè)定LOD值為3和最大重組值θ為0.50作為可信統(tǒng)計(jì)度與最大連鎖標(biāo)記數(shù)量之間的最佳組合，通過(guò)計(jì)算這些標(biāo)記與桃果肉紅色素性狀基因的遺傳距離。結(jié)果表明這些標(biāo)記分別位于桃參考遺傳連鎖圖譜的G2和G4兩個(gè)連鎖組，并分別與紅色素在皮下和果肉的分布以及紅色素在近核處果肉的分布

8、相連鎖。其中與紅色素在近核處果肉的分布的標(biāo)記為6個(gè)(UDP96-003、UDP97-402、Me01Em08、Me07Em02、CH04g09和Me07Em04)，與紅色素在皮下和果肉的分布的標(biāo)記3個(gè)(BPPCT023、CPPCT028和Me05Em03)，其中，SRAP標(biāo)記Me07Em02與桃果實(shí)近核色素的遺傳距離為0.0cM。
　　 3.通過(guò)將SRAP引物組合在重陽(yáng)紅×大久保雜交群體中的擴(kuò)增結(jié)果結(jié)合調(diào)查所得的近核色素?cái)?shù)據(jù)，利

9、用作圖軟件Mapmaker和回交群體模型進(jìn)行計(jì)算該標(biāo)記與桃果肉近核色素性狀基因的遺傳距離為2.1cM。
　　 通過(guò)對(duì)與桃果實(shí)近核色素的緊密連鎖的SRAP標(biāo)記Me07Em02擴(kuò)增片段的5個(gè)克隆的回收、T7/SP6雙向測(cè)序，所測(cè)序的5個(gè)克隆序列完全一致，其全長(zhǎng)110bp，其序列為:TGAGTCCAAACCGGTCCTGCTCAAGTGGAACCACATTGAGAACATGGCGCTCTAGCAGAGTGCAAAATAAGCAACTC

10、TTTCAGTCTGCCATTGCAAATTCGTACGCAGTC（下劃線部分序列為引物序列）。通過(guò)提交到桃基因組序列網(wǎng)站進(jìn)行BLASTn比對(duì)，該序列在桃基因組序列上是單一拷貝，位于桃基因組序列Peach v1.0的scaffold_4上，應(yīng)用DNAMAN序列分析軟件分析該序列，表明該序列最大ORF框?yàn)?08個(gè)bp，編碼36個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為:SPNRSC SSGTTLRTWRSSRQNKQLFQSAIANSYAV，該蛋白質(zhì)序列在

11、GenBank蛋白質(zhì)序列庫(kù)中沒(méi)有比對(duì)出相似序列。
　　 克隆了與桃果實(shí)果肉連鎖的其它SRAP標(biāo)記序列，其中一個(gè)是是桃反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的部分序列，另一個(gè)可能是putative calcium-transporting ATPase13的部分序列。
　　 4.根據(jù)獲得的桃反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的部分序列，應(yīng)用DANMAN和DNASTAR序列分析軟件輔助，在桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和GenBank中進(jìn)行BLASTn比對(duì)獲得了桃反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的全基因組序

12、列，位于Peach v1.0基因組的Scaffold-1的9939764bp-9944771bp位置，全長(zhǎng)5008bp，其左右兩邊的LTR完全一致，長(zhǎng)度為444bp，其最大ORF框位于該序列的487bp-4545bp，編碼1535個(gè)氨基酸，將該氨基酸序列提交到GenBank中進(jìn)行Protein BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示該序列也具有典型的copia-like反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的氨基酸序列特征。同時(shí)初步建立了桃反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子標(biāo)記方法，并對(duì)桃的遺傳多