IfimA型牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路和產(chǎn)生內(nèi)皮素-1-一氧化氮的研究.pdf

1、目的：分析IfimA型P.gingivalis脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和菌毛蛋白FimA誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)炎癥反應(yīng)的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及對(duì)HUVECs產(chǎn)生內(nèi)皮素-1/一氧化氮的影響。
　　 方法：1、體外培養(yǎng)HUVECs(CRL-2480)，待HUVECs單層融合后，分別與不同終濃度的IfimA型P.

2、gingivalis-LPS(0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/m)和rFimA(0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)共同培養(yǎng)2h、6h、24h，提取HUVECs總RNA，Real Time-PCR檢測(cè)CD14、TLR2(Toll-like receptor2)、TLR4(Toll-like receptor4)和MyD88(myeloiddifferentiation factor88)的mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞

3、術(shù)(FCM)檢測(cè)HUVECs膜表面CD14、跨膜受體TLR2和TLR4蛋白表達(dá)量；2、體外培養(yǎng)HUVECs(CRL-2480)，待HUVECs單層融合后，分別與不同終濃度的IfimA型P.gingivalis-LPS(0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)共同孵育2h、6h、24h，ELISA法測(cè)定ET-1的水平，硝酸還原酶法測(cè)定NO的水平。
　　 結(jié)果：1、IfimA型P.gingivalis-LPS在6h、24h時(shí)

4、誘導(dǎo)HUVECs CD14mRNA表達(dá)量增加，6h時(shí)CD14mRNA表達(dá)量增加呈濃度依賴性；IfimA型P.gingivalis-LPS在6h、24h時(shí)誘導(dǎo)HUVECs分泌CD14蛋白水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，與基因水平相符，且CD14蛋白水平的增加呈濃度依賴性，2h時(shí)I fimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVECs分泌CD14蛋白水平與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IfimA型P.gingiv

5、alis-LPS在2h、24h和6h時(shí)5ug/ml、10 ug/ml誘導(dǎo)HUVECs TLR2mRNA表達(dá)量增加，5ug/ml濃度下表達(dá)量增加呈時(shí)間依賴性；I fimA型P.gingivalis-LPS在6h、24h時(shí)誘導(dǎo)HUVECs分泌TLR2蛋白水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，與基因水平相符，2h時(shí)IfimA型P.gingivalis-LPS在5ug/ml和10ug/ml濃度下誘導(dǎo)HUVECs分泌TLR2蛋白水平高于陰性對(duì)照組(

6、P<0.05)。I fimA型P.gingivalis-LPS在6h、24h時(shí)誘導(dǎo)HUVECs TLR4mRNA表達(dá)量增加，24h時(shí)TLR4mRNA表達(dá)量增加呈濃度依賴性；IfimA型P.gingivalis-LPS在6h、24h時(shí)誘導(dǎo)HUVECs分泌TLR4蛋白水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，與基因水平相符，2h時(shí)IfimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)TLR4蛋白水平與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。I

7、fimA型P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVECs MyD88mRNA表達(dá)量增加，在2h和6h時(shí)MyD88mRNA表達(dá)量增加呈濃度依賴性，5ug/ml組MyD88mRNA相對(duì)表達(dá)量高于0.5ug/ml。
　　 2、IfimA型P.gingivalis-rFimA誘導(dǎo)HUVECs CD14mRNA表達(dá)量增加，6h和24h時(shí)CD14mRNA表達(dá)量增加呈濃度依賴性，10ug/ml濃度下誘導(dǎo)HUVECsCD14mRNA表達(dá)量增加

8、呈時(shí)間依賴性；6h時(shí)I fimA型P.gingivalis-rFimA誘導(dǎo)HUVECs分泌CD14蛋白水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，2h、24h時(shí)0.5ug/ml和5ug/ml組細(xì)胞分泌CD14蛋白水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，與基因水平相符。I fimA型P.gingivalis-rFimA在2h、6h時(shí)誘導(dǎo)HUVECs TLR2mRNA表達(dá)量增加，2h時(shí)TLR2mRNA表達(dá)量增加呈濃度依賴性；I fimA型P.gjngi

9、valis-rFimA在2h時(shí)誘導(dǎo)HUVECs分泌TLR2蛋白水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，與基因水平相符，6h時(shí)IfimA型P.gingivalis-rFimA誘導(dǎo)HUVECs分泌TLR2蛋白水平與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IfimA型P.gingivalis-rFimA在2h時(shí)誘導(dǎo)HUVECs TLR4mRNA表達(dá)量增加，且TLR4mRNA表達(dá)量增加呈濃度依賴性，6h和24h時(shí)TLR4mRNA表達(dá)量增加與

10、陰性對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I fimA型P.gingivalis-rFimA在2h、6h、24h時(shí)誘導(dǎo)HUVECs分泌TLR4蛋白水平與陰性對(duì)照組比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IfimA型P.gingivalis-rFimA在2h、6h和24h時(shí)誘導(dǎo)HUVECsMyD88mRNA表達(dá)量增加，2h和24h時(shí)MyD88mmRNA表達(dá)量增加呈濃度依賴性。
　　 3、IfimA型P.gingivalis-L

11、PS刺激HUVEC的ET-1分泌量增加，且隨LPS濃度的增加而減少(P<0.05)，在24h時(shí)分泌量達(dá)到最高峰。不同濃度I型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC的NO分泌量增加(P<0.05)，存在濃度依賴性和時(shí)間依賴性，在24h時(shí)分泌量達(dá)到最高峰。2h時(shí)0.5ug/ml、5ug/ml濃度下I fimA型P.gingivalis-LPS刺激HUVECs后ET-1/NO的水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，ET-1/NO的水平隨

12、LPS濃度的增加而降低(P<0.05)；6h、24h時(shí)5μg/ml和10μg/ml IfimA型P.gingivalis-LPS刺激HUVECs ET-1/NO的水平低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：P.gingivalis-LPS可通過CD14-TLR2/TLR4系統(tǒng)及MyD88依賴的信號(hào)通路參與P.gingivalis誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。IfimA型P.gingivalis-FimA刺激HUVECs通過TL