葛根素對子宮內(nèi)膜異位癥中芳香化酶P450調(diào)控機制的實驗研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometdosis,EM)是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮以外的雌激素依賴性疾病。而細(xì)胞色素芳香化酶P450(P450arom)在EM病理過程中起重要作用,目前采用芳香化酶抑制劑治療EM取得了較滿意的結(jié)果。最新研究表明植物雌激素可以抑制P450arom的表達(dá)和活性。葛根素是從中藥葛根中提取的異黃酮類植物性雌激素,我們認(rèn)為葛根素很可能成為治療EM十分有潛力的藥物。前期動物實驗顯示：葛根素能明顯抑制EM大鼠異位灶的生長及

2、異位灶組織P450arom的表達(dá)。本研究擬探討葛根素抑制P450arom表達(dá)的調(diào)控機制,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 研究內(nèi)容：①葛根素對RL95-2細(xì)胞P450arom表達(dá)的影響。②葛根素對RL95-2細(xì)胞P450arom基因表達(dá)調(diào)控的作用。⑨siRNA抑制c-jun表達(dá)后對RL95-2細(xì)胞P450arom表達(dá)的影響。 研究方法：①將梯度稀釋的葛根素在不同時間點加入RL95-2細(xì)胞中,分別采用Real-time PCR及

3、Western blotting方法檢測藥物對RL95-2細(xì)胞中P450arommRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。再通過酶促反應(yīng)采用放射免疫法檢測E2水平,了解P450arom活性的變化。②以人類基因組DNA為模板擴增人P450arom組織特異性啟動子2(P Ⅱ)轉(zhuǎn)錄起始位點上游序列。PCR產(chǎn)物定向克隆到報告基因載體pGL3-Basic中,分析轉(zhuǎn)錄因子并予缺失截斷,構(gòu)建人P450arom P Ⅱ系列報告基因質(zhì)粒,并經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化鑒定和基

4、因測序證實。瞬時轉(zhuǎn)染系列重組質(zhì)粒至RL95-2細(xì)胞,加入葛根素刺激,應(yīng)用熒光素酶活性檢測系統(tǒng)(Luciferase activity assay)明確葛根素的作用片段,并分析此片段的轉(zhuǎn)錄因子,利用Real-time PCR及Western blotting方法檢測相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在葛根素作用下mRNA及蛋白表達(dá)的變化,同時采用Luciferase activity assay檢測葛根素對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。③采用siRNA抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因

5、子表達(dá)后,再次檢測RL95-2細(xì)胞中P450arom在mRNA、蛋白以及酶活性水平的變化。 研究結(jié)果：①Real-time PCR檢測結(jié)果表明在不同濃度葛根素作用下細(xì)胞中P450arom mRNA表達(dá)呈雙向作用趨勢。與溶劑對照組比較高濃度葛根素刺激P450arom mRNA表達(dá)(P<0.01),而低濃度葛根素抑制其表達(dá)(P<0.01)。并以抑制作用最明顯的濃度(10-7mol/L)制時間曲線,結(jié)果顯示抑制作用在6h和12h時間點

6、較為顯著(P<0.01)。Western blotting結(jié)果表明,經(jīng)高濃度葛根素(10-3mol/L)處理后,RL95-2細(xì)胞中P450arom蛋白表達(dá)在24h時間點明顯增強,而葛根素(10-7mol/L)處理后其蛋白表達(dá)在12h和24h時間點出現(xiàn)明顯抑制。E2檢測結(jié)果表明,高、低濃度葛根素(10-3mol/L、10-7mol/L)在48h時間點與溶劑對照組比較分別刺激和抑制E2水平,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),同時陽性對照組(來

7、曲唑)對E2的抑制作用更為顯著(P＜0.01)。②經(jīng)酶切鑒定、基因測序、轉(zhuǎn)錄因子分析及啟動子活性測定,成功構(gòu)建了人P450arom(P Ⅱ)系列重組質(zhì)粒(-1017,-763,-543,-234～+8bp)。瞬時轉(zhuǎn)染系列質(zhì)粒至細(xì)胞中,于12h后加入葛根素(10-7mol/L)刺激,又12h后檢測熒光蛋白水平。結(jié)果表明：-763bp～543bp間的活性被抑制(P＜0.05),通過轉(zhuǎn)錄因子分析找到了-410/-401bp的AP-1(c-ju

8、n/c-fos)。利用Real-time PCR、Western blotting及Luciferase activity assay檢測發(fā)現(xiàn)葛根素(10-7mol/L)對AP-1(c-jun/c-fos)的抑制作用平行于對P450arom的作用。③Real-time PCR檢測結(jié)果表明c-jun siRNA沉默其mRNA表達(dá)(P＜0.01),同時P450arom mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.01)。Western blotting及

9、E2檢測結(jié)果表明,c-jun siRNA瞬時轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,P450arom蛋白表達(dá)及E2水平分別在12h和48h時間點被抑制(P＜0.05)。 研究結(jié)論：①葛根素對RL95-2細(xì)胞P450arom的作用具有雙向性,低濃度抑制P450arom表達(dá)及活性,而高濃度起刺激作用。②成功構(gòu)建人P450arom(P Ⅱ)系列報告基因質(zhì)粒。葛根素(10-7mol/L)對位于-410/-401bp的c-jun的表達(dá)及AP-1的活性具有抑制作用,