葛根素對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥芳香化酶基因表達(dá)調(diào)控路徑的研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮以外的雌激素依賴性疾病。其異位灶的生長除依賴于卵巢產(chǎn)生的雌激素外，還依賴于異位灶自分泌的雌激素。研究表明，異位內(nèi)膜組織高表達(dá)細(xì)胞色素芳香化酶P450(P450arom)，而P450arom．是雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的限速酶和關(guān)鍵酶，目前臨床上使用芳香化酶抑制劑治療EMS取得了較滿意的治療效果。但是這些藥物均具有肝功能損害、低雌激素狀態(tài)所致更年期樣改變等副作用，

2、不能長期服用。且服藥期間異位灶組織仍存在，一旦停藥，異位灶容易死灰復(fù)燃。植物雌激素作為弱活性的雌激素分子占據(jù)了受體的結(jié)合部位，對(duì)生殖期婦女起到抗雌激素活性作用。同時(shí)最新研究表明植物雌激素(phytoestrogens)還可以抑制P450arom的表達(dá)。葛根素(puerarin)是從中藥葛根中提取的異黃酮類植物雌激素，根據(jù)植物雌激素的作用特點(diǎn)和EMS病理特征我們認(rèn)為葛根素很可能是治療EMS潛在的藥物。前期研究顯示葛根素能明顯抑制EMS大鼠

3、異位灶的生長，抑制異位灶組織及內(nèi)膜細(xì)胞P450arom的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)主要研究葛根素影響子宮內(nèi)膜異位癥芳香化酶基因表達(dá)的調(diào)控路徑，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 研究目的： 1、通過觀察葛根素對(duì)雌激素反應(yīng)元件(ERE)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，明確葛根素與雌激素受體亞型ERα、ERβ的親和力。 2、在雌激素受體拮抗劑ICI182780作用下，進(jìn)一步觀察葛根素對(duì)ERE熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活是否依賴雌激素

4、受體途徑。 3、在有無ICI182780作用下，觀察葛根素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(RL95-2)P450arom表達(dá)的影響，明確葛根素是否通過雌激素受體途徑(estrogen receptor，ER)抑制芳香化酶P450的表達(dá)。 研究方法： 1、分別將ERα/β表達(dá)質(zhì)粒與雌激素反應(yīng)元件ERE的熒光素酶報(bào)告基因(2ERE-39PRL-Luc)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到ER表達(dá)缺失的宮頸癌細(xì)胞(HeLa)中，轉(zhuǎn)染12h后，加入梯度稀釋的

5、葛根素與雌激素作用刺激，利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。探討不同濃度下葛根素與ERα/β的親和力。 2、將ERα/β表達(dá)質(zhì)粒與雌激素反應(yīng)元件ERE的熒光素酶報(bào)告基因(2ERE-39PRL-Luc)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到ER表達(dá)缺失的HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染12h后加入ICI182780(10-5mol/L)和葛根素(10-4mol/L)共同作用HeLa細(xì)胞，利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測其熒光素酶活性。研究ICI182780對(duì)葛根素轉(zhuǎn)錄激

6、活機(jī)制的影響。 3、在RL95-2細(xì)胞中加入雌激素受體拮抗劑ICI182780(10-5mol/L)作用0.5h后，進(jìn)一步加入葛根素(10-7mol/L)，分別使用Real-time PCR以及Western blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測葛根素對(duì)RL95-2細(xì)胞P450arom的mRNA水平和蛋白水平的影響。分析葛根素是否通過ER途徑抑制芳香化酶P450的表達(dá)。 研究結(jié)果： 1、將ERE熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)

7、染HeLa細(xì)胞后，葛根素和雌激素對(duì)ERE熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活無明顯影響。當(dāng)將ERα或ERβ與ERE熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，(10-4mol/L-10-9mol/L)葛根素和(10-4mol/L-10-9mol/L)雌激素均可誘導(dǎo)ERE熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活。而低濃度(10-9mol/L)葛根素只能通過ERβ途徑激活ERE熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄，對(duì)過表達(dá)ERα的HeLa細(xì)胞則沒有明顯作用，提示葛根素

8、與ERβ親和力更高。 2、在ERα或ERβ過表達(dá)的HeLa細(xì)胞中，ICI182780(10-5mol/L)能夠完全阻斷葛根素(10-4mol/L)和雌激素(10-5mol/L)對(duì)過表達(dá)ERα的HeLa細(xì)胞中ERE熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活作用；而在過表達(dá)ERβ的HeLa細(xì)胞中，ICI182780同樣能完全阻斷雌激素的轉(zhuǎn)錄激活作用，能部分阻斷葛根素的轉(zhuǎn)錄激活作用。 3、在加入葛根素(10-7mol/L)或雌激素(10-

9、5mol/L)的RL95-2細(xì)胞中，雌激素受體拮抗劑ICI182780(10-5mol/L)能夠明顯影響RL95-2細(xì)胞P450arom的mRNA水平和蛋白水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葛根素是通過ER途徑抑制芳香化酶P450的表達(dá)。 結(jié)論： 1、低濃度的葛根素只能通過ERβ激活ERE熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，提示葛根素與ERβ親和力更高。 2、ICI182780能完全阻斷雌激素和部分葛根素對(duì)ERE的轉(zhuǎn)錄激活作用，表明葛根素與