基底膜及其主要成分-Ⅳ型膠原對表皮角質形成細胞分化的影響.pdf

1、目的：
　　探討正常皮膚與瘢痕皮膚在組織結構學與細胞學中的差異，分析差異產(chǎn)生的原因，發(fā)現(xiàn)瘢痕組織的分化狀態(tài)可能是由于缺少正常基底膜所致。使用基底膜主要組成成分Ⅳ型膠原鋪板離體培養(yǎng)表皮干細胞，分析其在增殖分化過程中與空白對照組表皮干細胞在生物學特性等方面的異同點，驗證基底膜及其主要組成成分Ⅳ型膠原是否在抑制表皮干細胞分化過程中起重要作用。
　　方法：
　　采用HE染色法認識正常皮膚與瘢痕皮膚結構，基底膜六胺銀染色法分析對

2、比正常皮膚與瘢痕皮膚基底膜結構差異，組織間接免疫熒光法探尋正常皮膚與瘢痕中的表皮角質形成細胞定位，分析不同分化階段的表皮角質形成細胞在正常皮膚與瘢痕皮膚中分布與遷移規(guī)律差異。采用改良的Ⅳ型膠原鋪板選擇黏附法分離培養(yǎng)人ESCs，觀察其形態(tài)及增值分化的特點，并進行細胞間接免疫熒光鑒定。同時，繼續(xù)以Ⅳ型膠原鋪板作為實驗組，以不鋪Ⅳ型膠原做為對照組，采用高鈣離子濃度(1.5mM)培養(yǎng)基培養(yǎng)表皮干細胞，以高鈣刺激時間長短不同制造不同分化程度細胞模

3、型。用Western blot及RT-PCR技術研究表皮角質形成細胞在不同處理因素下的表型變化，探討基底膜及其主要組成成分Ⅳ型膠原在表皮角質形成細胞分化“命運”中的影響作用。
　　結果：
　　在體研究中發(fā)現(xiàn)正常皮膚中角質形成細胞在從基底層經(jīng)棘層和顆粒層到角質層的分化及向上遷移過程中，經(jīng)歷了有序的成熟模式，這一過程與基底膜的正常結構和功能密切相關。而瘢痕組織由于缺少了基底膜成分，細胞分化狀態(tài)紊亂，提前進入分化過程。采用改良的Ⅳ

4、型膠原差速黏附法能夠高效的分離表皮中的干細胞，分選出的細胞具有干細胞的形態(tài)特點且表達CK19、β1整合素；在高鈣離子濃度(1.5mM)培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)下，兩組細胞均隨刺激時間延長體積變大，折光性變?nèi)?，核漿比變小，進而出現(xiàn)聚集分層現(xiàn)象，而經(jīng)過同時長高鈣離子培養(yǎng)基刺激的兩組細胞，鋪了Ⅳ型膠原的實驗組細胞相較對照組體積小，細胞聚集及分層現(xiàn)象均出現(xiàn)較遲，形態(tài)學上更趨近于未分化特性。RT-PCR和Western-blot檢測結果發(fā)現(xiàn)Ⅳ型膠原黏附培養(yǎng)

5、表皮干細胞后，實驗組細胞中CK19的表達較對照組增強，同時做為短暫擴充細胞標志的CK14以及作為終末分化細胞標志的CK10，在無Ⅳ型膠原鋪板組中的表達明顯高于膠原組，同樣再次支持了Ⅳ型膠原抑制表皮細胞分化的現(xiàn)象。
　　結論：
　　ESCs并非真正靜止的未分化細胞，而是一種已經(jīng)進入分化狀態(tài)但是仍具有多向分化潛能的干細胞，其增殖分化行為不但受到自身程序化基因表達的影響，同時又受到其所處的微環(huán)境-基底膜及其成分的調控。Ⅳ型膠原能夠