囊泡膜結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白VAP33對小鼠樹突狀細胞肉瘤生物學特性的影響.pdf

1、侵襲性和轉(zhuǎn)移性是惡性腫瘤最重要的特征，也是腫瘤患者死亡的主要原因，目前已證實腫瘤轉(zhuǎn)移是基因調(diào)控下的多階段、多因素、多步驟的過程，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究雖然有了長足的發(fā)展，但其分子機制遠遠沒有闡明。因此研究發(fā)現(xiàn)并證實與腫瘤轉(zhuǎn)移過程高度相關(guān)的基因，深入了解這些基因在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用及機制仍是研究熱點。
　　 囊泡膜結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白VAP33是一類特殊的蛋白，分為VAPA，VAPB，VAPC三個亞型，通過與VAMP(vesicleas

2、sociatedmembraneprotein)結(jié)合發(fā)揮囊泡運輸作用。本實驗室前期工作，在基因和蛋白水平證實VAP33的表達程度跟腫瘤細胞的肺轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)[1-3]；Pastric.S也發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移癌組織較原發(fā)癌中VAPA高表達[4]。作為一種調(diào)節(jié)囊泡運輸?shù)牡鞍祝琕AP33在腫瘤細胞生物學及腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機制鮮有報道。本研究在參考前期工作及相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，進一步探討VAP33在腫瘤惡性行為發(fā)生中的作用。
　　 本研究采用

3、了具有低轉(zhuǎn)移特性的兩個細胞株：小鼠樹突狀肉瘤細胞DG6和小鼠肺腺癌細胞LA1作為體外模型，通過建立穩(wěn)定過表達VAP33蛋白的細胞株(DG6-VAP33、LA1-VAP33)來觀察細胞的變化。
　　 首先，本研究構(gòu)建了表達VAP33-GFP融合蛋白的表達載體、建立了DG6-VAP33和LA1-VAP33細胞株。根據(jù)GeneBank中VAP33的mRNA序列設(shè)計一對引物，在正反引物的5’端分別加入PmeI和MluI酶切位點及保護堿基

4、。通過RT-PCR技術(shù)從DCS細胞的cDNA中擴增出VAP33，利用基因重組技術(shù)，將目的基因克隆到載體pWPXL的PmeI/MluI酶切位點之間，構(gòu)建重組載體，經(jīng)測序該載體構(gòu)建成功．之后本研究采用慢病毒包裝技術(shù)，將重組病毒質(zhì)粒(pWPXL-VAP33)與兩種包裝質(zhì)粒(PsPAX2、MD2G)在脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導下共轉(zhuǎn)染293T細胞（人胚腎細胞），包裝出重組慢病毒，分別以不同的MOI值感染目的細胞。通過熒光顯微鏡

5、挑選，WB鑒定獲得VAP33穩(wěn)定過表達細胞株(DG6-VAP33和LA1-VAP33)。
　　 接下來本研究又觀察VAP33過表達對惡性腫瘤細胞生物學特性的影響。
　　 本研究檢測了腫瘤細胞在形態(tài)、體積、增殖、集落形成、運動和侵襲能力方面的改變，同時設(shè)立DG6、LA1細胞為對照組。細胞分析計數(shù)儀CasyTT檢測細胞大小，DG6和DG6-VAP33細胞的平均直徑分別為16.58μm和15.79μm，細胞大小無明顯變化；核漿

6、比分別為1∶4.66(DG6)和1∶3.99(DG6-VAP33)；通過顯微鏡觀察，過表達前后的DG6細胞形態(tài)也無明顯變化；DG6-VAP33和LA1-VAP33集落數(shù)分別為（36±5）個/孔和（21±3）個/孔，低于其對照組（52±8）個/孔和（28±4）/孔，P＜0.05，說明VAP33抑制腫瘤細胞體外增殖能力；劃痕實驗顯示VAP33與DG6細胞體外運動能力沒有明顯關(guān)系；transwell方法觀察到，DG6-VAP33細胞體外侵襲能

7、力顯著下降，穿膜細胞數(shù)(28±22)少于DG6(72±34)，P＜0.01，而LA1-VAP33體外侵襲能力無明顯改變，說明VAP33與腫瘤細胞侵襲能力的關(guān)系需更多實驗研究確定。以上結(jié)果說明，VAP33過表達降低了腫瘤細胞的體外增殖能力。
　　 為進一步明確過表達VAP33在體內(nèi)水平上對惡性腫瘤的作用，本研究建立了小鼠皮下移植瘤模型，觀察該蛋白對腫瘤細胞體內(nèi)增殖、成瘤、轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，DG6-VAP33組腫瘤生長速度顯