LTβR-Ig通過LIGHT向未成熟樹突狀細(xì)胞傳遞刺激信號影響其生物學(xué)功能的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、關(guān)于未成熟DCs表面表達(dá)的LIGHT是否可以直接向未成熟DCs傳遞信號,影響未成熟DCs功能,目前國內(nèi)外也未見報道。然而用可溶性受體蛋白作用于DCs,模擬T細(xì)胞與DCs之間的信號通路,研究相應(yīng)共刺激通路的反向信號的文章,已見報道。例如,用可溶性CTLA-4-Ig模擬T細(xì)胞表面的CTLA-4,作用于DCs表達(dá)的B7-1/B7-2,發(fā)現(xiàn)CTLA-4-Ig可以刺激DCs產(chǎn)生IFN-γ;后者通過誘導(dǎo)吲哚胺2、3過氧化酶(IDO)活性增強(qiáng),大量分

2、解T細(xì)胞增殖分化所必須的氨基酸——色氨酸,從而抑制活化T細(xì)胞的增殖;該效應(yīng)在維持母體和胎兒之間的免疫耐受、抑制T細(xì)胞對腫瘤、自身抗原及MHC不相容移植物的反應(yīng)具有重要作用。此外,表達(dá)在B細(xì)胞上的B7-2也可傳遞逆向信號給B細(xì)胞,刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IgG1和IgE;這種作用對于B7-2高表達(dá)的記憶B細(xì)胞特別重要。說明,B7分子不僅可通過CD28/CTLA-4正向傳遞共刺激信號或共抑制信號給T淋巴細(xì)胞,還可以逆向傳遞信號給抗原遞呈細(xì)胞或B淋巴細(xì)

3、胞,調(diào)節(jié)它們的免疫功能,以達(dá)到調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答的目的。另外,可溶性CD28(CD28-Ig)可以通過B7-1、B7-2促進(jìn)DCs分泌IL-6和IFN-γ:CD28-Ig處理過的DCs可以增強(qiáng)機(jī)體T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤、抗微生物免疫應(yīng)答以及MHC-I類抗原限制性遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。由此可見,B7-CTLA-4和B7-CD28均可以互為配受體,具有雙向傳遞信號的能力;也反映出共刺激分子對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的、多樣性的。 除了B7家族成

4、員可以傳遞反向信號之外,TNF家族成員也有相似功能。最近報道的TNFR超家族成員GITR與其配體GITRL便可互為配受體,可以雙向傳遞信號,調(diào)控免疫反應(yīng)。LIGHT作為TNF家族的新成員,可以作為共刺激分子,為Τ細(xì)胞的活化提供刺激信號,同時還可以誘導(dǎo)骨髓增生異常綜合征(MDS)病人來源的未成熟DCs的成熟。這些已有的相關(guān)研究都主要集中在LIGHT與不同的受體結(jié)合之后,發(fā)揮的不同生物學(xué)功能,那么LIGHT自身是否也可以向其表達(dá)細(xì)胞傳遞信號

5、,它與其受體之間是否也互為配受體,目前尚未見報道。 本課題就上述問題展開研究,用LTβR-Ig融合蛋白作為工具,初步探討LIGHT是否可以傳遞信號作用于未成熟DCs,對未成熟DCs的表型及功能產(chǎn)生影響,進(jìn)而起到免疫調(diào)節(jié)作用。所得研究結(jié)果,將進(jìn)一步豐富LIGHT-共刺激通路的理論知識。 第一部分 驗證LTβR-Ig融合蛋白可與未成熟DCs表面LIGHT有效結(jié)合 LTβR-Ig與未成熟DCs的有效結(jié)合是本課題的研究基

6、礎(chǔ),因此必須對LTβR-Ig的生物學(xué)活性及其結(jié)合效力進(jìn)行驗證。 (1)首先檢測LTβR-Ig的生物學(xué)活性 [方法]:將C57BL/6小鼠的脾臟單個核細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞,BALB/C小鼠的脾臟單個核細(xì)胞經(jīng)過絲裂霉素處理后,作為刺激細(xì)胞,兩種細(xì)胞1:1混合培養(yǎng),并加入LTβR-Ig或者對照人IgG,或與融合蛋白相同體積的PBS。3天后檢測3[H]-TdR摻入量。 [結(jié)論]:單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)證實了LTβR-Ig可以有

7、效阻斷LIGHT-HVEM信號通路,對同種異基因混合淋巴細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。 (2)檢測LTβR-Ig與未成熟DCs的特異性結(jié)合 [方法]:先用間接標(biāo)記的方法,即先用大鼠抗小鼠LIGHT抗體與不同成熟狀態(tài)的DCs結(jié)合,然后加入熒光標(biāo)記的抗大鼠的二抗,流式細(xì)胞儀檢測不同成熟狀態(tài)的DCs表面LIGHT的表達(dá)水平。同樣是間接標(biāo)記法,再檢測LTβR-Ig與未成熟DCs的結(jié)合效力,設(shè)抗LIGHT抗體阻斷對照及IgG對照。

8、 [結(jié)論]:LTβR-Ig可以特異性識別未成熟DCs表達(dá)的LIGHT。 第二部分 LTβR-Ig融合蛋白對小鼠未成熟DCs表型、抗原吞噬及遞呈功能的影響 本部分實驗以LTβR-Ig體外模擬LTβR與未成熟DCs表面LIGHT的結(jié)合,觀察LIGHT被激活后,是否可以直接向未成熟DCs傳遞信號,對未成熟DCs的免疫表型、抗原吞噬能力和抗原遞能力造成影響。 [方法]:用GM-CSF、IL-4體外擴(kuò)增C578L/6

9、小鼠骨髓來源的DCs,于擴(kuò)增的第5天收集細(xì)胞,并用CD11c磁珠純化,得到高純度的未成熟DCs。然后體外繼續(xù)培養(yǎng),并在培養(yǎng)體系中加入LTβR-Ig(終濃度為5μg/ml)或相同終濃度的IgG或與融合蛋白等體積的PBS:①于加入蛋白后24h、48h分別檢測DCs的免疫表型;②加入蛋白后24h收集各組DCs,用FITC標(biāo)記的卵白蛋白(FITC-OVA)作為抗原,檢測各組DCs對該抗原的吞噬能力,流式細(xì)胞儀檢測PE-CD11c+DCs中,FI

10、TC-OVA+細(xì)胞的百分率及平均熒光強(qiáng)度,用以反映DCs的吞噬能力③收集不同蛋白作用24h后各組DCs,與CFSE預(yù)染的OVA323-339肽特異性CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng)84h,流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞CFSE的熒光強(qiáng)度,用以反應(yīng)不同處理組DCs的抗原遞呈能力。 [結(jié)論]:從DCs的免疫表型、抗原吞噬及抗原遞呈功能等方面,初步說明ITβR-LIGHT信號通路可以反向傳遞刺激信號給未成熟DCs,誘導(dǎo)DCs的成熟。 第三

11、部分 LTβR-Ig對DCs分泌細(xì)胞因子及抗原特異性CD4+T細(xì)胞生物學(xué)功能的影響 進(jìn)一步深入探討LTβR-Ig誘導(dǎo)DCs成熟的機(jī)制。 [方法]:用ELISA和Realtime-PCR的方法,分別從蛋白質(zhì)水平和mRNA水平檢測DCs分泌IL-12、IL-10、IL-6、TNF-a等細(xì)胞因子及趨化因子的水平。檢測了DCs與OVA323-339肽特異性T細(xì)胞混合培養(yǎng)后,T細(xì)胞的胞內(nèi)及上清中IL-2、IL-4、IFN-γ的表達(dá)

12、水平。 [結(jié)論]:IL-6在DCs的成熟過程中發(fā)揮著重要作用。LTβR-Ig促進(jìn)DCs成熟,促進(jìn)抗原特異性CD4+T細(xì)胞分泌Th2型細(xì)胞因子均是通過促DCs高分泌IL-6實現(xiàn)的。 為了排除實驗過程中可能存在的LPS污染,我們使用的所有金屬器具均經(jīng)過250℃高溫烘烤30min以上,滅活LPS。所有塑料器具均是一次性無熱源產(chǎn)品。此外,還實驗證實了無LPS污染。 [方法]:將LTβR-Ig煮沸10min,使之完全變性之

13、后再作用于未成熟DCs,觀察未成熟DCs分泌IL-6的水平。 [結(jié)果]:煮沸后LTβR-Ig不能促進(jìn)DCs高分泌IL-6,與對照組無差異。 [結(jié)論]:DCs分泌IL-6增高不是LPS污染導(dǎo)致的,而是LTβR-Ig與LIGHT特異性結(jié)合所引起的。 第四部分 LTβR/LIGHT信號通路對DCs及T細(xì)胞功能影響的體內(nèi)實驗研究 本部分主要是對體外實驗的體內(nèi)驗證。 [方法]:①抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng):將

14、LTβR-Ig處理24h的C57BL/6小鼠骨髓來源的DCs,與CFSE預(yù)染的OVA323-339肽特異性CD4+T細(xì)胞按1:10的比例混合(DCs:5×105/只;T:5×106/只),經(jīng)尾靜脈回輸入小鼠體內(nèi),同時尾靜脈注射入200nmol的OVA323-339肽,在無病原菌的環(huán)境下飼養(yǎng)3天后處死動物。取脾和淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞,用PE-CD4流式抗體標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測脾及淋巴結(jié)中CFSE陽性細(xì)胞的增殖情況,ELISA檢測血清中細(xì)胞

15、因子的表達(dá)水平。②同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng):先將BALB/C小鼠的脾臟單個核細(xì)胞用CD4和CD8磁珠進(jìn)行陽性篩選,得到富集的T細(xì)胞,并用CFSE染色。然后LTβR-Ig處理C57BL/6來源第5天DCs24之后,與CFSE預(yù)染的BALB/C小鼠來源的脾臟及淋巴結(jié)T細(xì)胞胞以1:10比例混合(DCs:5×105/只;T:5×106/只)后,經(jīng)尾靜脈注射入8Gry60Go照射后的正常BALB/C小鼠體內(nèi),3天后處死動物,取脾和淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞

16、,用PE-CD4流式抗體標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測脾及淋巴結(jié)中CFSE陽性細(xì)胞的增殖情況,ELISA檢測血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平。 [結(jié)果]:與體外實驗一致,LTβR-Ig處理過的DCs回輸入體內(nèi)后,對抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)以及同種異基因混合淋巴細(xì)胞的增殖,均起到刺激作用。并且促進(jìn)T細(xì)胞分泌IL-4,部分增強(qiáng)Th2型免疫反應(yīng)。 在本研究中,首次用LTβR-Ig融合蛋白為工具,研究LIGHT-信號通路是否存在反向信號。首先

17、,用流式細(xì)胞術(shù)的方法證實LTβR-Ig可以與DCs表面的LIGHT分子有效結(jié)合,在此基礎(chǔ)上研究LTβR-Ig通過LIGHT對DCs狀態(tài)及功能的影響。從DCs細(xì)胞的免疫表型、細(xì)胞因子的分泌、吞噬能力和抗原遞呈能力等各方面的實驗結(jié)果均顯示LTβR-Ig促進(jìn)DCs的成熟,增強(qiáng)DCs對抗原特異性T淋巴細(xì)胞的刺激能力,提示LTβR-LIGHT對DCs的免疫功能存在反向調(diào)節(jié)作用。最后,通過尾靜脈回輸LTβR-Ig作用過的DCs,體內(nèi)證實LTβR-I

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