磷酸萘酚喹抗藥性機(jī)制的研究.pdf

1、瘧疾是世界上發(fā)病率和死亡率最高的蟲媒傳染病之一。在四種寄生于人體的瘧原蟲中,惡性瘧原蟲感染人導(dǎo)致的惡性瘧癥狀最為嚴(yán)重,死亡率也最高。自惡性瘧原蟲對氯喹產(chǎn)生抗藥性以來,瘧原蟲的抗藥性不斷蔓延,抗性程度不斷增強(qiáng),在某些地區(qū)甚至出現(xiàn)了多藥抗性、交叉抗性,使瘧疾防治面臨嚴(yán)峻困難,甚至影響了新藥的使用。美軍從1963—1974年用12年時(shí)間從25萬個(gè)化合物中篩選出26個(gè)較有希望的新化合物進(jìn)入臨床研究,其中只有4--喹啉甲醇類中的甲氟喹被美軍作為王

2、牌藥推向市場,但甲氟喹上市僅半年在泰國就報(bào)道出現(xiàn)抗性。對此,國內(nèi)外學(xué)者對抗瘧藥抗性機(jī)制展開了大量研究。但目前唯一能確定抗性機(jī)制的僅有抗葉酸藥,認(rèn)為惡性瘧原蟲二氫葉酸還原酶(Dihyrofolateredctase, DHFR)基因的突變導(dǎo)致了這類藥物抗性的產(chǎn)生,而其他常用抗瘧藥如氯喹等喹啉類抗瘧藥的抗性機(jī)制目前仍未明確。
　　磷酸萘酚喹是我所研制的Ⅰ類抗瘧新藥,與氯喹同屬4-氨基喹啉類抗瘧藥。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,磷酸萘酚喹具有很高的抗瘧

3、活性。臨床實(shí)驗(yàn)顯示磷酸萘酚喹消除半衰期長達(dá)255h以上。長半衰期藥物的優(yōu)點(diǎn)是臨床用藥療程短、依從性好,缺點(diǎn)是由于血液中較長時(shí)間存在低濃度藥物,故與短半衰期藥物相比容易產(chǎn)生抗性。因此,為保護(hù)新藥,更合理地使用新藥,延長新藥的使用壽命,有必要對我國研制的抗瘧新藥磷酸萘酚喹抗性產(chǎn)生的情況及其抗性機(jī)制進(jìn)行了解和研究。
　　目前國內(nèi)外均未見有關(guān)磷酸萘酚喹抗性機(jī)制的報(bào)道,但對氯喹的抗性機(jī)制已有大量的研究報(bào)道。研究普遍認(rèn)為惡性瘧原蟲多藥抗性基因

4、1(Plasmodium falciparum multidrug resistance gene1,pfmdr1)、cg2和惡性瘧原蟲氯喹抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter, pfcrt)基因與氯喹抗性有關(guān),其中研究的熱點(diǎn)是crt基因,認(rèn)為crt突變是氯喹抗性產(chǎn)生的關(guān)鍵。因此,本實(shí)驗(yàn)從crt基因入手,利用基因打靶技術(shù)展開磷酸萘酚喹抗性機(jī)制的研究

5、。
　　對基因功能研究最直接有效的辦法就是進(jìn)行等位基因替換,目前在瘧原蟲體內(nèi)進(jìn)行的等位基因替換實(shí)驗(yàn)大多是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)完成的。pPyrFlu是伯氏瘧原蟲轉(zhuǎn)染的有效介質(zhì),將質(zhì)粒載體與crt基因構(gòu)建得到CRT targeting重組質(zhì)粒,通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù),利用質(zhì)粒可進(jìn)行的單交換機(jī)制,將敏感株和抗性株的crt等位基因進(jìn)行替換來研究crt基因與磷酸萘酚喹抗性的關(guān)系。
　　方法:(1)首先建立磷酸萘酚喹抗性株模型。在鼠瘧動(dòng)物模型上采

6、用小劑量遞增(ST)法培育磷酸萘酚喹抗性株,經(jīng)4日抑制實(shí)驗(yàn)法測定ED50、ED90和抗性指數(shù)I50、I90;停藥體內(nèi)血傳10代及冷凍保存12個(gè)月檢測該抗性株抗性是否穩(wěn)定;測定交叉抗性,評價(jià)該抗性株對青蒿素、氯喹、本芴醇和乙胺嘧啶等的藥物敏感性;(2)參考伯氏瘧原蟲ANKA株的crt基因設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄及PCR引物,獲得K173株、NQR株、CQR株的crt基因,分析所得目的基因與其它瘧原蟲crt基因和蛋白的同源性并比較磷酸萘酚喹抗性株crt基

7、因與K173株、CQR株crt基因之間的差別;(3)構(gòu)建CRT突變重組株并對其抗性表型進(jìn)行鑒定。首先是crt Targetting質(zhì)粒的構(gòu)建,將K173株或抗性株的crt基因片段克隆到伯氏瘧原蟲轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pPyrFlu中,獲得以單交換機(jī)制整合的重組質(zhì)粒PyrFlu/Pbcrt,經(jīng)雙酶切及PCR鑒定;其次是轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化,通過重組質(zhì)粒線性化,伯氏瘧原蟲體外培養(yǎng)和設(shè)定不同的電轉(zhuǎn)體系選擇最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件;再次是乙胺嘧啶藥物篩選及熒光顯微鏡下觀察獲

8、得陽性轉(zhuǎn)化子并做 PCR鑒定;最后,測定重組 K173-NQR/CQR株、NQR-K173株和CQR-K173株對磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性分析重組株抗性表型的變化。
　　結(jié)果:(1)在磷酸萘酚喹的持續(xù)壓力下血傳100代,歷時(shí)23個(gè)月培育得到了伯氏瘧原蟲磷酸萘酚喹高度抗性株 NQR,經(jīng)測定 ED50、ED90分別為41.25mg/kg和152.23mg/kg,抗性指數(shù)I50和I90分別為105.8和200.3,均達(dá)到高度抗性;經(jīng)停藥

9、血傳10代和冷凍保存12個(gè)月測定,其抗性指數(shù)仍然保持200以上,未發(fā)生明顯變化,說明其抗性程度比較穩(wěn)定;交叉抗性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該抗性株對青蒿素、本芴醇和乙胺嘧啶具有中度交叉抗性,而與氯喹具有高度交叉抗性(I90=14.5);(2)經(jīng)RT-PCR首次擴(kuò)增得到了伯氏瘧原蟲K173株的crt基因編碼序列,經(jīng)序列測定目的基因長1278bp,編碼426個(gè)氨基酸,具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;經(jīng)比對該序列與其它瘧原蟲的crt基因和蛋白具有很高的同源性

10、;序列比對發(fā)現(xiàn)NQR株目的基因全長1275bp,編碼425個(gè)氨基酸,與K173株相比,NQR株crt基因存在41個(gè)堿基突變及3個(gè)堿基缺失,其中有意義的氨基酸突變有11個(gè);NQR株、CQR株的crt基因序列相同;(3)得到以單交換機(jī)制獲得整合的重組質(zhì)粒PyrFlu/Pbcrt,經(jīng)雙酶切及PCR鑒定,證明目的基因crt已整合到載體中;體外培養(yǎng)伯氏瘧原蟲同步化于成熟裂殖體期的優(yōu)化條件為20％胎牛血清的1640培養(yǎng)基,細(xì)胞壓積比1％,在37℃蠟

11、燭缸中培養(yǎng)18-22h;分別采用梯度密度離心法和磁珠分選法富集成熟裂殖體,比較富集得到的裂殖體比例及裂殖體活性,發(fā)現(xiàn)兩種方法所獲裂殖體質(zhì)量均較好,無較大差別,只是操作時(shí)間上存在差別,梯度密度離心法富集裂殖體需要30min而磁珠分選法需要2h以上;選擇100-400ul不同的電轉(zhuǎn)體系,1.1kv,25uF,電阻無窮大的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,只在300ul電轉(zhuǎn)體系中獲得了陽性轉(zhuǎn)化子;經(jīng)2輪乙胺嘧啶篩選后的陽性轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光,經(jīng)

12、PCR鑒定也擴(kuò)增得到了2kb的預(yù)期片段,說明重組質(zhì)粒已正確地整合在伯氏瘧原蟲基因組中并進(jìn)行了表達(dá);(4)經(jīng)測定,重組K173-NQR/CQR株的藥物敏感性顯著下降,對磷酸萘酚喹、氯喹的ED90分別為36.06±2.79mg/kg和93.70±8.83mg/kg,抗性表型I90分別為60.1和44.2;而重組NQR-K173株對磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性則顯著提高,ED90分別為2.76±0.79mg/kg和6.92±1.07mg/kg,I

13、90分別為4.6和11.5;重組CQR-K173株對磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性也顯著提高,ED90分別為4.66±1.32mg/kg和19.08±3.39mg/kg,I90分別為2.2和9.0。
　　結(jié)論:(1)通過ST法培育得到穩(wěn)定的磷酸萘酚喹抗性株,實(shí)驗(yàn)顯示磷酸萘酚喹在鼠瘧模型上很容易產(chǎn)生抗性,且抗性程度高而強(qiáng)。因此,對其抗性機(jī)制的研究很有必要。研究證實(shí),該抗性株對氯喹具有高度交叉抗性,提示我們在氯喹抗性區(qū)使用磷酸萘酚喹時(shí)要提高

14、警惕,避免抗性程度的交叉累積。本研究提示,磷酸萘酚喹的抗性機(jī)制與氯喹有相同之處但不完全相同;(2)首次獲得伯氏瘧原蟲K173株的crt基因;分析結(jié)果說明該基因突變很有可能與NQR抗性產(chǎn)生有關(guān),且該基因與磷酸萘酚喹抗性產(chǎn)生的關(guān)系與氯喹抗性產(chǎn)生類似;(3)建立了伯氏瘧原蟲基因打靶技術(shù),并運(yùn)用此技術(shù)獲得了表達(dá)NQR株crt基因、CQR株crt基因的重組伯氏瘧原蟲K173株和表達(dá)K173株crt基因的重組伯氏瘧原蟲NQR株、CQR株;(4)通過